尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在代谢DON中的用途制造技术

本发明专利技术公开了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型（UGT 1A1）基因在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂的用途，属于分子生物学领域。由此，本发明专利技术提供了DON在肝脏代谢的关键调控因子，为饲料中DON的暴露量评估提供科学依据，也为动物代谢DON能力评估提供方便有效的指标。本发明专利技术还公开了利用检测UGT 1A1的转录水平来评估动物代谢DON能力的方法，能够准确、方便、快速地完成评估。本发明专利技术公开的UGT 1A1在制备动物脱毒剂中的用途，对能够促进排泄、减少残留，降低DON毒性的新的脱毒剂的开发具有重要的作用和意义。

【技术实现步骤摘要】
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在代谢DON中的用途
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型在动物代谢DON中的用途。
技术介绍
近年来由生物毒素污染造成的食品安全问题日益突显，尤其是真菌毒素污染，由此引发的技术性贸易壁垒和国际贸易纠纷不断发生，因此预防和控制真菌毒素污染成为全球农业、环境、卫生及食品等科学领域共同关注的热点。真菌毒素是由自然界中广泛存在的真菌遇到适宜的温度和湿度在小麦、玉米等谷物中生长繁殖、产生的次级代谢有毒有害物质，对谷物产品和饲料危害很大。据联合国粮农组织(FAO)资料，全球每年因农产品和饲料真菌毒素污染造成的直接或间接经济损失达数百亿美元，主要包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主)等。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)产生。主要污染麦类、玉米等谷物，畜禽误食被谷物污染的饲料后，极易引起厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，据DON的剂量和暴露时间不同还可造成免疫抑制或免疫刺激，严重时损害造血系统甚至死亡。此外，DON还具有很强细胞毒性、免疫毒性和胚胎毒性，对机体内细胞信号传导和基因表达均有不同程度的影响。不同动物对DON的敏感程度不一样，猪最敏感，其次是小鼠>大鼠>家禽>反刍动物。敏感性差异主要与DON在体内的残留、代谢转化、消除速率有关。然而，DON在动物体内的代谢、消除规律，关键代谢酶的功能特性及表达调控机制仍有待深入研究。DON在生物体内的代谢过程非常复杂，研究发现在动物的尿液和粪便中检测到DON的主要代谢产物是脱环氧DON(DOM1)，由肠道或瘤胃微生物脱环氧作用完成。近年来随着研究的深入，发现DON主要是在肝脏发生II相代谢反应，与葡萄糖醛酸结合，形成葡萄糖醛酸缀合物。从而使DON脂溶性减弱，水溶性增强，更有利于体内排出、降低毒性作用。DON在不同动物肝微粒体培养结果显示，葡萄糖醛酸苷化反应主要发生在3、15羟基部位，7羟基部位，且存在明显的物种差异。在人尿液中DON主要以DON-3-葡萄糖醛酸的形式排出，比例达到91％，最近Warth等(WarthB,SulyokM,FruhmannP,etal.Developmentandvalidationofarapidmultibiomarkerliquidchromatography/tandemmassspectrometrymethodtoassesshumanexposuretomycotoxins.RapidCommunMassSpectrom.2012,26:1533-1540.在此全文引入作为参考)又在人尿液中检测到DON-15-葡萄糖醛酸，鼠尿中也发现了两种不同的葡萄糖醛酸代谢产物，提示葡萄糖醛酸代谢产物可能作为人类食物和动物饲料中DON膳食暴露量评估的生物标志物。然而，猪和鼠的肝微粒体体外试验未见有DON代谢产物，但在仔猪、小鼠等肝微粒体培养中发现有DON的代谢产物，推测DON葡萄糖醛酸反应具有种间和物种差异性。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(Uridinediphosphateglucuronosyltransferase，UGT)是生物体内催化Ⅱ相代谢途径葡萄糖醛酸结合反应的主要功能酶。UGT是一个超基因家族，在人已确认的UGT亚型有19种，可分为UGT1和UGT2两个家族以及UGT1A、UGT2A和UGT2B三个亚族[13]。但在猪机体内，通过基因克隆和基因产物的表达，已确定的UGT亚型只有UGT2B31、UGT2B4、UGT2A1、UGT1AB3四种。UGT不同亚型的表达，除受添加药物作用影响外，与年龄、饮食、疾病状态、种族差异、遗传多态性以及激素水平等密切相关。UGT位于内质网膜和核膜上，在不同脏器和组织如肾脏、脑、皮肤、肠、脾、胸腺、心脏等都有不同程度表达，但以肝细胞中的活性最强。在不同组织中UGT能催化一系列的内源性和外源性亲脂糖苷配基底物(如胆红素、甾体激素、药物、杀虫剂等)的葡萄糖醛酸结合过程，将亲脂性的葡萄糖醛酸(glucuronicacid，GA)转移至亲脂性底物的-OH、-SH、-NH2、-COOH、甚至于烯醇化合物上，增强化合物的水溶性，促进其排泄，是机体重要的解毒途径之一。DON作为含有多个-OH基团的烯醇类化合物，在不同动物和人的肝微粒体酶系体外研究，代谢产物为DON-3-葡萄糖醛酸和DON-15-葡萄糖醛酸，结合人和鼠尿液中DON的代谢产物，推测DON在肝脏主要发生葡萄糖醛酸反应，是机体对真菌毒素DON脱毒反应的主要途径。猪作为DON最敏感的动物，如何提高肝脏葡萄糖醛酸反应速率，促进排出、减少残留、降低毒性，成为畜牧生产的需求，尚未得到解决。
技术实现思路
为了解决上述技术问题的至少一个，专利技术人选择饲料真菌毒素污染范围最广泛的DON为研究目标，以DON最敏感动物猪的肝细胞为研究对象，通过采用体外实验观察法，从DON主要在肝脏中转化、代谢角度出发，以DON葡萄糖醛酸结合反应中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)功能作用研究为突破口，采用Real-timePCR、酶活性分析、Western-blot等技术，出乎意料地筛选出DON葡萄糖醛酸代谢关键酶基因。进一步地，专利技术人通过基因克隆、Bac-to-Bac重组表达系统、酶活性动力学以及LC-MS/MS技术对DON代谢产物分析，验证了该关键酶基因的功能和作用。从而完成本专利技术。本专利技术的第一方面提供尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT1A1)在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂中的用途。在本专利技术的实施方案中，所述脱毒剂为口服制剂和注射制剂。在本专利技术的实施方案中，所述脱毒剂中UGT1A1含量为0.025mg/mL。本专利技术的第二方面提供尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT1A1)基因在制备用于评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的试剂盒中的用途。在本专利技术的实施方案中，所述脱毒剂中包括能够扩增UGT1A1基因的转录产物的至少一部分序列的引物对。在本专利技术的具体实施方案中，所述转录产物为mRNA。在本专利技术的具体实施方案中，所述转录产物包括mRNA的反转录产物cDNA。在本专利技术的实施方案中，所述引物对分别具有SEQIDNO.9和SEQIDNO:10所示的核苷酸序列。在本专利技术的具体实施方案中，所述动物为猪。本专利技术的第三方面提供一种评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的方法，包括以下步骤：获取所述动物的RNA样本；测定UGT1A1基因的转录水平，如果UGT1A1基因的转录水平高于参考基因的转录水平，则所述动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力较强，反之较弱。在本专利技术的实施方案中，所述测定UGT1A1基因的转录水平是利用逆转录定量PCR的方法进行的，所用引物对分别具有SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。在本专利技术的实施方案中，其特征在于，所述动物为猪。本专利技术的有益效果本专利技术提供了DON在肝脏代谢的关键调控因子，为饲料中DON的暴露量评估提供科学依据，也为动物代谢DON能力预测提供方便本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT1A1)在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT1A1)在制备用于促进动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的脱毒剂中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脱毒剂为口服制剂和注射制剂。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脱毒剂中UGT1A1含量为0.025mg/mL。4.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1亚型(UGT1A1)基因在制备用于评估动物代谢脱氧雪腐镰刀菌烯醇能力的试剂盒中的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述脱毒剂中包括能够扩增UGT1A1基因的转录产物的至少一部分序列的引物对。6.根据权利要求4-5任一所述的用途，其特征在于，所述引物对分别具有SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊花，赵志辉，王建华，郭文博，杨宪立，张志岐，陈晓芳，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31