利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法技术

利用BA‑ELISA检测烟粉虱抗药性的方法，它涉及一种烟粉虱抗药性的检测方法。本发明专利技术解决了现有技术存在的稳定性和重复性差、成本高、特异性和敏感性不佳的问题，而提供了一种利用BA‑ELISA检测烟粉虱抗药性的方法。本发明专利技术方法：一、粗酶液用匀浆液稀释后加入酶标板包被；二、抗体用1％BSA溶液稀释后加入到酶标板中的每个孔中，再加入反应缓冲液进行孵育；三、加入链酶亲和素进行孵育；四、加入显色剂进行显色。本发明专利技术的检测方法稳定性和重复性均比较好，具有优异的特异性和敏感性。

Detection of drug resistance of Bemisia tabaci by BA-ELISA

【技术实现步骤摘要】
利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法
本专利技术涉及一种烟粉虱抗药性的检测方法。
技术介绍
烟粉虱(BemisiatabaciGennadius)是危害极为广泛的世界性害虫之一，通过直接刺吸为害、传播植物病毒等，引起植物生理紊乱、分泌蜜露诱发真菌病害给作物生产造成巨大的经济损失。近年来烟粉虱对我国重要农业经济产业如棉花、蔬菜、设施农业的危害呈现不断上升势头，对农民增收及农业可持续发展造成严重威胁。随着大量化学药剂的不合理使用，烟粉虱对包括新烟碱类在内的多种类型杀虫剂已产生不同程度的抗性。吡虫啉、噻虫嗪是目前防治烟粉虱的常用药剂，研究表明烟粉虱对这些新烟碱类药剂的抗性机制主要涉及细胞色素P450基因的过表达。实施对烟粉虱的早期抗性检测，有利于制定合理有效的防控措施，降低灾害威胁，保障农业安全，促进农民增收，对社会稳定和发展有积极的促进作用。现有技术中利用竞争ELISA法和双抗夹心ELISA法检测烟粉虱抗药性，但是这两种方法稳定性和重复性均比较差，特异性和敏感性不佳。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术存在的稳定性和重复性差、特异性和敏感性不佳的问题，而提供了一种利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法。本专利技术利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法按照以下步骤进行：一、烟粉虱成虫粉碎成粗酶液，用匀浆液稀释后加入酶标板包被，然后用洗脱液洗涤3～5次；二、烟粉虱P450靶标蛋白的抗体用1％BSA溶液稀释至浓度为0.5μg/mL的稀释液，然后加入到步骤一所述酶标板经包被的孔中，并加入反应缓冲液进行孵育，之后用洗脱液洗涤3～5次；三、链酶亲和素与1％BSA溶液按照体积比为1:200混合后加入到步骤二所述酶标板经孵育的孔中进行二次孵育，然后用洗脱液洗涤3～5次；四、向步骤三所述酶标板经二次孵育的孔中加入显色剂进行显色，即完成了烟粉虱抗药性的检测；其中，步骤一所述的匀浆液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和浓度为100mM的苯甲基磺酰氟乙醇溶液按照100:1的体积比混合而成；步骤一、步骤二和步骤三所述的洗脱液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和曲拉通按照1000:1的体积比组成；步骤二所述的反应缓冲液是按照重量份数由50份的0.01M、pH为7.4的PBS溶液、0.05份的曲拉通、0.5份的牛血清蛋白和0.5份的N-十二烷基-β-D-麦芽糖混合而成。根据亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)有很强亲和力的原理，将生物素-亲和素系统(Biotin-AvidinSystem,BAS)的放大效应与酶联免疫方法(ELISA)方法相结合的液相生物素-亲和素ELISA检测技术，提高了ELISA方法检测的特异性、敏感性。该方法通过抗原与生物素抗体形成复合物，以及生物素与酶标记的链霉亲和素分子高特异性的结合，由于BAS的多级放大作用，使每个抗体携带的酶分子的显色反应显著增加，从而极大地提高灵敏度。本专利技术是通过烟粉虱细胞色素P450靶基因抗原与标记生物素的抗体特异性结合形成复合物，以及标记辣根过氧化物酶(HRP)的亲和素与生物素的结合，加入显色底物，在HRP的催化下反应生成蓝色的产物，抗原含量越高，反应产物呈现的蓝色越深，从而达到了检测烟粉虱抗药性的目的。本专利技术反应缓冲液中N-十二烷基-β-D-麦芽糖(DDM)及曲拉通(Triton)为表面活性剂，两者结合更有效的防止非特异性吸附。本专利技术的检测方法提供一种对现有检测抗性技术的结合应用，从而改进并专利技术一种新的有效检测技术，弥补生物测定及分子生物学抗性检测的周期较长、试虫样本量较大或操作繁杂的缺点，本专利技术的方法高效、快捷、特异性高、准确掌握烟粉虱对吡虫啉抗性水平的检测技术。与ELISA法和双抗夹心ELISA法相比较，本专利技术的检测方法稳定性和重复性均比较好，检测成本低，具有优异的特异性和敏感性。附图说明图1是新疆不同烟粉虱种群使用本专利技术方法检测的显色结果；图2是不同烟粉虱种群P450基因CYP4G68蛋白的相对含量；图3是采用三组不同的匀浆液对烟粉虱CYP4G68的检测结果；图4是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-SA)采用三种不同的溶液稀释后对烟粉虱CYP4G68的检测结果。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法按照以下步骤进行：一、烟粉虱成虫粉碎成粗酶液，用匀浆液稀释后加入酶标板包被，然后用洗脱液洗涤3～5次；二、烟粉虱P450靶标蛋白的抗体用1％BSA溶液稀释至浓度为0.5μg/mL的稀释液，然后加入到步骤一所述酶标板经包被的孔中，并加入反应缓冲液进行孵育，之后用洗脱液洗涤3～5次；三、链酶亲和素与1％BSA溶液按照体积比为1:200混合后加入到步骤二所述酶标板经孵育的孔中进行二次孵育，然后用洗脱液洗涤3～5次；四、向步骤三所述酶标板经二次孵育的孔中加入显色剂进行显色，即完成了烟粉虱抗药性的检测；其中，步骤一所述的匀浆液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和浓度为100mM的苯甲基磺酰氟乙醇溶液按照100:1的体积比混合而成；步骤一、步骤二和步骤三所述的洗脱液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和曲拉通按照1000:1的体积比组成；步骤二所述的反应缓冲液是按照重量份数由50份的0.01M、pH为7.4的PBS溶液、0.05份的曲拉通、0.5份的牛血清蛋白和0.5份的N-十二烷基-β-D-麦芽糖混合而成。本实施方式步骤一所述的粗酶液的制备方法是：烟粉虱成虫加入到匀浆液中，用样品破碎仪在4℃条件下破碎3～10min，即得到了粗酶液；其中烟粉虱成虫和匀浆液的重量比为1:250～260；其中，匀浆液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和浓度为100mM的苯甲基磺酰氟乙醇溶液按照100:1的体积比混合而成。本实施方式步骤二和步骤三所述的1％BSA溶液由浓度为0.01mol/L、pH为7.4的PBS溶液和牛血清蛋白按照100:1的重量比组成。本实施方式步骤二中加入生物素标记的烟粉虱P450靶标蛋白的抗体，烟粉虱P450靶标蛋白的抗体为烟粉虱CYP4G68抗体，来自于南京金斯瑞生物科技有限公司。本实施方式步骤三中链酶亲和素为辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，其原理为加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，与生物素标记抗体进行结合，链酶亲和素购于R&DSYSTEMS。本实施方式步骤五中显色反应时间为15～20min。本实施方式所述的烟粉虱抗药性是指新疆地区烟粉虱对吡虫啉的抗性。本实施方式是通过烟粉虱细胞色素P450靶基因抗原与标记生物素的抗体特异性结合形成复合物，以及标记辣根过氧化物酶(HRP)的亲和素与生物素的结合，加入显色底物，在HRP的催化下反应生成蓝色的产物，抗原含量越高，反应产物呈现的蓝色越深，从而达到了检测烟粉虱抗药性的目的。本实施方式的N-十二烷基-β-D-麦芽糖(DDM)及曲拉通(Triton)为表面活性剂，两者结合可更有效的防止非特异性吸附。与利用竞争ELISA法和双抗夹心ELISA法检测烟粉虱抗药性相比较，本实施方式的方法稳定性和重复性均比较好，检测成本低，有优异的特异性和敏感性。具体实施方式二：本实施方式与具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用BA‑ELISA检测烟粉虱抗药性的方法，其特征在于利用BA‑ELISA检测烟粉虱抗药性的方法按照以下步骤进行：一、烟粉虱成虫粉碎成粗酶液，用匀浆液稀释后加入酶标板包被，然后用洗脱液洗涤3～5次；二、烟粉虱P450靶标蛋白的抗体用1％BSA溶液稀释至浓度为0.5μg/mL的稀释液，然后加入到步骤一所述酶标板经包被的孔中，并加入反应缓冲液进行孵育，之后用洗脱液洗涤3～5次；三、链酶亲和素与1％BSA溶液按照体积比为1:200混合后加入到步骤二所述酶标板经孵育的孔中进行二次孵育，然后用洗脱液洗涤3～5次；四、向步骤三所述酶标板经二次孵育的孔中加入显色剂进行显色，即完成了烟粉虱抗药性的检测；其中，步骤一所述的匀浆液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和浓度为100mM的苯甲基磺酰氟乙醇溶液按照100:1的体积比混合而成；步骤一、步骤二和步骤三所述的洗脱液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和曲拉通按照1000:1的体积比组成；步骤二所述的反应缓冲液是按照重量份数由50份的0.01M、pH为7.4的PBS溶液、0.05份的曲拉通、0.5份的牛血清蛋白和0.5份的N‑十二烷基‑β‑D‑麦芽糖混合而成。...

【技术特征摘要】
1.利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法，其特征在于利用BA-ELISA检测烟粉虱抗药性的方法按照以下步骤进行：一、烟粉虱成虫粉碎成粗酶液，用匀浆液稀释后加入酶标板包被，然后用洗脱液洗涤3～5次；二、烟粉虱P450靶标蛋白的抗体用1％BSA溶液稀释至浓度为0.5μg/mL的稀释液，然后加入到步骤一所述酶标板经包被的孔中，并加入反应缓冲液进行孵育，之后用洗脱液洗涤3～5次；三、链酶亲和素与1％BSA溶液按照体积比为1:200混合后加入到步骤二所述酶标板经孵育的孔中进行二次孵育，然后用洗脱液洗涤3～5次；四、向步骤三所述酶标板经二次孵育的孔中加入显色剂进行显色，即完成了烟粉虱抗药性的检测；其中，步骤一所述的匀浆液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和浓度为100mM的苯甲基磺酰氟乙醇溶液按照100:1的体积比混合而成；步骤一、步骤二和步骤三所述的洗脱液由0.01M、pH为7.4的PBS溶液和曲拉通按照1000:1的体积比组成；步骤二所述的反应缓冲液是按照重量份数由50份的0.01M、pH为7.4的PBS溶液、0.05份的曲拉通、0.5份的牛血清蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜卫华，王强，王美娜，吐尔逊，付文君，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32