丝状菌变异株及使用其的C4二羧酸的制造方法技术

本发明专利技术提供一种具有C4二羧酸生产能力提高效果的丝状菌变异株、及使用有该丝状菌变异株的C4二羧酸的制造方法。本发明专利技术的C4二羧酸的制造方法，其包括：将由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化的丝状菌变异株进行培养。

Mutants of filamentous fungi and the manufacturing method of their C4 dicarboxylic acid

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】丝状菌变异株及使用其的C4二羧酸的制造方法
本专利技术涉及一种丝状菌变异株及使用其的C4二羧酸的制造方法。
技术介绍
C4二羧酸作为酸味料或抗菌剂、pH调节剂在食品工业中被利用于各种各样的用途，此外，也用作合成树脂或生物分解性聚合物的原料使用等，为工业的价值高的物质。C4二羧酸通过工业上源自石化原料的化学合成、或微生物发酵的任一种来制造。从前，为了更低成本，化学合成法为主流，但近年来，从原料的昂贵、或环境负荷等的观点出发，通过以循环再生资源为原料的微生物发酵的制造方法备受关注。已知有作为C4二羧酸之一的富马酸可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌而制造。根霉属菌以葡萄糖为碳源生产富马酸，排出至菌体外。迄今为止，关于用于根霉属菌的富马酸高生产化的方法，已知有利用培养法的改良或变异育种的高生产率菌株的制作等。但是，根霉属菌的遗传学的背景还没有充分地研究，因此，利用基因重组的根霉属菌的富马酸高生产化技术的开发不容易，报道也少。仅报道有将编码源自酿酒酵母的丙酮酸羧化酶的基因导入至戴尔根霉(专利文献1)、及将编码源自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因导入至米根霉(非专利文献1)导致的富马酸生产率提高。专利文献1：中国专利申请公开第103013843号说明书非专利文献1：MetabolicEngineering,2012,14:512-520
技术实现思路
本专利技术涉及以下的[1]～[4]。[1]一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括：将丝状菌变异株进行培养，所述丝状菌变异株由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化。[2]一种丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶的表达被强化。[3]一种丝状菌变异株的制造方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。[4]一种C4二羧酸生产能力的提高方法，其中，包括：在宿主丝状菌中，将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。具体实施方式本专利技术涉及提供一种具有C4二羧酸生产能力提高效果的丝状菌变异株、及使用有该丝状菌变异株的C4二羧酸的制造方法。本专利技术人对使用有丝状菌的C4二羧酸的制造进行了深入研究的结果发现：增强了过氧化氢酶的表达的丝状菌株使其C4二羧酸生产能力提高。本专利技术的丝状菌变异株可以提高C4二羧酸的生产能力，更快地生产C4二羧酸。因此，本专利技术的丝状菌变异株是为了C4二羧酸的生物学的生产而有用的。本专利技术的上述及其它特征及优点由以下的本说明书的记载进一步明确。(1.定义)本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性利用Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)来计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件GENETYCSVer.12的同源性分析(Searchhomology)程序、将Unitsizetocompare(ktup)作为2进行分析来算出。本说明书中，与氨基酸序列或核苷酸序列有关的“至少90％的同一性”是指：90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选99％以上的同一性。本说明书中的“1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列”是指：1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸被缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。另外，本说明书中的“1个或多个核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列”是指：1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步更优选1个以上9个以下的核苷酸被缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。本说明书中，在氨基酸或核苷酸的“附加”中，包含对序列的一个末端及两个末端的氨基酸或核苷酸的附加。本说明书中，与基因有关的“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”意指在DNA有义链中基因存在于启动子的3’侧，基因的上游意指DNA有义链中的该基因的5’侧的区域。本说明书中，控制区域和基因的“可操作的连结”是指：基因和控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连结。基因和控制区域的“可操作的连结”的步骤是本领域技术人员所公知的。本说明书中，对于微生物的功能或性状、特性所使用的用语“本来”是为了表示该功能或性状、特性存在于该微生物的野生型而使用。对照而言，用语“外来”是原来不存在于该微生物、为了表示从外部所导入的功能或性状、特性而使用。例如，“外来”基因或多核苷酸是从外部导入至微生物的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以源自与导入其的细胞同种的生物，也可以源自异种的生物(即，异种基因或多核苷酸)。。本说明书中，微生物的“C4二羧酸生产能力”是作为该微生物的培养培养基中的C4二羧酸的生产速度表示，更详细而言，将该微生物的培养开始后至经过一定时间时通过该细胞所生产的C4二羧酸的培养基每体积的质量用培养时间除所得的值(g/L/h)表示。微生物的C4二羧酸的生产量可以作为从该微生物的培养物中除去了微生物的培养上清液中的C4二羧酸的量算出。培养上清液中的C4二羧酸的量可以利用高效液相色谱法(HPLC)等进行测定。更具体的测定步骤例示于后述的参考例1。本说明书中，丝状菌变异株中的“C4二羧酸生产能力的提高”是指：该变异株的C4二羧酸生产能力与宿主或对照相比提高。丝状菌变异株中的C4二羧酸生产能力的提高率用以下的式子计算。提高率(％)＝(变异株的C4二羧酸生产能力/宿主或对照的C4二羧酸生产能力)×100－100在此，变异株是指相对于宿主微生物加入了所给予的特性变化的改变的微生物，宿主是指成为该变异的导入对象的微生物(亲微生物株)。作为对照，可举出：与加入了与该变异株相同的改变的宿主不同种的微生物、或不加入该改变的宿主(例如导入有空载体或对照序列的宿主)。优选丝状菌变异株中的C4二羧酸生产能力的提高率基于该丝状菌变异株引起的C4二羧酸的生产速度成为最大的时点的、各丝状菌株的C4二羧酸生产能力进行计算。本说明书中，“C4二羧酸生产能力提高X％以上的变异株”是指用上述式计算的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上的变异株，另外，丝状菌中的“C4二羧酸生产能力的X％以上的提高”意指用上述式计算的该丝状菌的C4二羧酸生产能力的提高率为X％以上。作为由本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括：将丝状菌变异株进行培养，所述丝状菌变异株由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.01 JP 2016-2343801.一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括：将丝状菌变异株进行培养，所述丝状菌变异株由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽的表达被强化。2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，还包括：从所述培养物中回收C4二羧酸。3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述C4二羧酸为富马酸、苹果酸或琥珀酸。4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，丝状菌变异株是在宿主丝状菌中将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达而成的丝状菌变异株，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸，3)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，4)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有过氧化氢酶活性的多肽的多核苷酸。5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，宿主丝状菌为根霉属菌。6.一种丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶的表达被强化。7.根据权利要求6所述的丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶为源自根霉属菌的过氧化氢酶。8.根据权利要求6所述的丝状菌变异株，其中，过氧化氢酶为由序列号2所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有过氧化氢酶活性的多肽。9.根据权利要求8所述的丝状菌变异株，其中，是在宿主丝状菌中将选自以下的1)～4)中的多核苷酸以可表达的方式导入、或强化该多核苷酸的表达而成的，1)编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，2)由与序列号2具有至少90％的同一性的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：野中镜士朗，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP