一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA制造技术

本发明专利技术公开了一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA。采用同源置换的原理，构建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2基因缺失突变体，并进行了非生物胁迫测试和致病力分析，结果显示经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl2处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱；此外，结合小RNA深度测序获得各突变体小RNA，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施等提供理论和技术支撑。

A DCL Gene Deletion Mutant of Banana Fusarium oxysporum race 4 and Its Small RNA

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA
本专利技术涉及一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA，属于生物工程

技术介绍
小RNA，包括miRNA和siRNA，是一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过剪切靶标mRNA或转录抑制的方式导致序列特异性的转录后基因沉默调控，均由类似RNaseIII的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生。Dicer(DCL)作为一种特异性核糖核酸内切酶参与了小RNA生物合成途径，Dicer的作用机制分两步：第一步，Dicer与dsRNA结合形成酶-dsRNA复合体，在ATP的作用下将dsRNA解螺旋并将其切割产生5'端磷酸基、3'端羟基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs；第二步，小片段的siRNA与含有PAZ功能域的Argonaute(AGO)蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)，该复合体具有序列特异性的核酸内切酶活性，能够特异性的降解与siRNA同源的靶标mRNA。真菌也能编码与植物的miRNA类似的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，通过以下方法获得：1)构建Foc4DCL1基因缺失重组DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH，原生质体转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；还可以采用相同的方法敲除DCL2基因，构建Δdcl2突变体；2)在Δdcl1突变体的基础上构建Foc4DCL1/2双基因缺失重组DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因，原生质体转化，获得Foc4DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，通过以下方法获得：1)构建Foc4DCL1基因缺失重组DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH，原生质体转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；还可以采用相同的方法敲除DCL2基因，构建Δdcl2突变体；2)在Δdcl1突变体的基础上构建Foc4DCL1/2双基因缺失重组DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因，原生质体转化，获得Foc4DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体。2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δdcl1突变体的构建方法为：第一轮PCR扩增：左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL1-LBCK和DCL1-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1699bp；右端RB：以FOC4基因组DNA为模板，DCL1-HPH-RB-F和DCL1-RBCK为引物，扩增产物大小1920bp；潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；第二轮PCR扩增：左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL1-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2310bp；右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL1-RB-R为引物，扩增产物大小2269bp；将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示。3.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δdcl2突变体的构建方法为：第一轮PCR扩增：左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1957bp；右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK为引物，扩增产物大小1837bp；潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；第二轮PCR扩增：左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL2-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2682bp；右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL2-RB-R为引物，扩增产物大小2103bp；其中，DCL2-LBCK、DCL2-HPH-LB-R、DCL2-HPH-RB-F、DCL2-RBCK、...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，曾凡云，张欣，漆艳香，谢培兰，谢艺贤，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46