膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶技术

本发明专利技术公开了一种膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶，其中方法是将向待成像的生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，然后结合机械切削对该膨胀组织进行切削和成像，从而实现生物组织的三维膨胀切削显微成像，实现三维超分辨成像。本发明专利技术通过对关键的膨胀物质作用，尤其是对生物组织在这些膨胀物质作用下硬度值要求等进行控制，与后续重复切削‑成像过程相配合，能够有效解决超分辨成像对组织厚度的限制以及组织样本较软、难以切削、且易滑动导致图像漂移等问题，可以实现现有技术难以达到的对于较厚的生物组织三维超分辨成像。

Expansion Cutting Microscopic Imaging Method and Super Absorbent Hydrogel Applicable to the Method

【技术实现步骤摘要】
膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶
本专利技术属于荧光显微成像领域，更具体地，涉及一种膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶，利用膨胀切削显微成像方法尤其可实现大体积生物组织样本的三维超分辨成像。
技术介绍
膨胀显微镜(ExM)是近年来发展起来一种超分辨的技术，它是将生物样本在可膨胀的聚电解质水凝胶中聚合形成致密的交联网络，吸水后将样本在物理上均匀放大，经过这样的物理放大后，衍射受限区域的分子在空间中被分离到更大的距离，因此即使使用传统的衍射受限显微镜也可以分辨。不像其他的超分辨技术需要依赖于特殊的仪器(如超分辨显微镜)，ExM技术与传统显微镜(例如，宽场显微镜、共聚焦显微镜等)相兼容，使细胞和组织在普通、快速、衍射受限的显微镜下实现对标本进行三维纳米级分辨率成像。目前各种膨胀因子(三维方向均匀膨胀的倍数)的ExM已经被发展起来。由最初的4×发展到了10×，最新的技术甚至达到了～4.5×4.5≈20×，成像分辨率也由70nm发展到了15nm。研究者们在追求膨胀因子(即膨胀倍数，膨胀因子越高，相应的成像分辨率越高)达到极致的情况下，却忽略了超吸水水凝胶的硬度。目前用于膨胀显微镜的超吸水聚合物均是以丙烯酸钠作为吸水试剂，另外以少量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺与之交联形成聚合物网络，吸水膨胀后水凝胶的胶体质地非常软，无法直接用手支撑，实际操作困难。在成像过程中将水凝胶置于玻片上时极易滑动，图像会出现漂移现象，导致聚焦模糊，后期图像处理麻烦。最重要的是，这种质地较软的水凝胶无法用于机械切削成像，即使利用大体积成像的光片照明显微镜，受限于其物镜工作距离(8mm)，最多只能也获取厚度为2mm的组织(膨胀4倍的情况下)的数据，不利于更大体积的样本的数据获取。另外，目前所有的超分辨显微镜都无法实现大体积生物组织的成像。基于以上提出的问题以及当前对大体积生物组织三维网络超分辨成像的需求，急需建立一种新的超分辨成像方法，利用膨胀显微镜实现生物组织的超分辨成像，同时保证膨胀的样本具有足够的硬度，与机械切削荧光显微镜相结合，利用切削原理打破目前超分辨成像对样本厚度的限制，实现完整组织块的三维超分辨成像。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶，其中通过对关键的膨胀物质作用，尤其是对生物组织在这些膨胀物质作用下硬度值要求等进行控制，与后续重复切削-成像过程(如序列切削-成像过程)相配合，与现有技术相比能够有效解决组织样本较软、难以切削、且易滑动导致图像漂移、难以实现三维超分辨成像等问题，可以实现现有技术难以达到的对于厚的、或大体积生物组织三维超分辨成像。并且，本专利技术中特定组成及配比的超吸水水凝胶，尤其适用于该生物组织膨胀切削成像方法，可以使膨胀后的膨胀组织其硬度达到15KPa以上，并且能够使样本组织三维各个方向放大≥4倍(体积放大≥100倍)，在普通光学显微镜成像的条件下实现超分辨(≥250nm/4＝62.5nm的分辨率)的效果；同时与机械切削策略结合，打破目前超分辨成像对样本厚度的限制，实现大体积生物样本的三维超分辨成像。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种膨胀切削显微成像方法，其特征在于，该方法是将向待成像的初始生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使所述初始生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，然后结合机械切削对该膨胀组织进行切削和显微成像，从而实现生物组织的三维膨胀切削显微成像，获取三维超分辨数据，实现三维超分辨成像。作为本专利技术的进一步优选，所述膨胀物质为超吸水水凝胶，所述初始生物组织与所述超吸水水凝胶交联聚合后吸水膨胀形成硬度不低于15KPa的凝胶块，该凝胶块即为膨胀组织；所述超吸水水凝胶的吸水后膨胀倍数≥2倍，优选为≥4倍。作为本专利技术的进一步优选，所述将向待成像的初始生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使所述初始生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，具体包括以下步骤：(1)组织锚定：将荧光标记的生物组织使用甲基丙烯酸N-羟琥珀酸亚胺酯(MA-NHS)或者6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯(AcX)对生物组织中蛋白质进行锚定；(2)水凝胶渗透：将步骤(1)中获得的锚定后的生物组织置于配制完成的超吸水水凝胶溶液中进行渗透；(3)水凝胶聚合：将步骤(2)中获得渗透后的生物样本置于聚合槽中，加入新的超吸水水凝胶溶液中，聚合槽表面进行封片，然后将聚合槽置于含有水的湿盒中，放入烘箱进行聚合；(4)蛋白酶K消化：将步骤(3)中获得聚合后的生物样本置于蛋白酶K消化液中消化；(5)去离子水中透析膨胀：将步骤(4)获得消化后的生物组织置于去离子水中透析，每隔1h换一次去离子水，重复3～5次，直至膨胀至样本体积最大。作为本专利技术的进一步优选，所述结合机械切削对膨胀组织进行切削和显微成像，具体包括如下步骤：(a)以所述膨胀组织的表层作为第一层成像层，在荧光显微镜下激发成像，获得第一层的成像，然后切削掉该第一层成像层，得到一次切削后的膨胀组织；(b)将步骤(a)得到的一次切削后的膨胀组织其表层作为第二层成像层，在荧光显微镜下激发成像，获得第二层的成像，然后切削掉该第二层成像层，得到二次切削后的膨胀组织；(c)重复先荧光激发成像、后切削的过程，依次得到第三层、第四层、……的成像，从而得到所述膨胀组织的系列二维图像，然后对这些二维图像进行叠加处理，即可实现整个膨胀组织的三维超分辨成像。作为本专利技术的进一步优选，所述结合机械切削对膨胀组织进行切削和显微成像具体是利用自动切削荧光显微镜。按照本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种适用于膨胀切削显微成像方法的超吸水水凝胶，其特征在于，该超吸水水凝胶主要由超吸水化合物、单体、交联剂、引发剂和加速剂组成，其中，超吸水化合物、单体、交联剂、引发剂和加速剂五者的质量之比满足(10-15)：(10-20)：(0.5-2)：(0.5-1)：(0.5-1)。作为本专利技术的进一步优选，按重量份计，每100份的超吸水水凝胶中，包括10-15份的超吸水化合物，10-20份的单体，0.5-2份的交联剂，0.5-1份的引发剂，以及0.5-1份的加速剂，其余组分为去离子水。作为本专利技术的进一步优选，所述超吸水化合物为亲水化合物，优选为丙烯酸、甲基丙烯酸、海藻酸、衣康酸、巴豆酸、马来酸、意大利酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)、乙烯醇、醋酸乙烯、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种；更优选为AMPS、衣康酸、马来酸、意大利酸、乙烯醇、醋酸乙烯中的一种或多种；所述单体为丙烯酰胺或N,N-二甲基丙烯酰胺，优选为丙烯酰胺；所述交联剂为双丙烯酰胺；所述引发剂为过硫酸铵(APS)或者过硫酸钾(KPS)，优选为APS；所述加速剂为四甲基乙二胺(TEMED)。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了上述超吸水水凝胶作为膨胀物质在生物组织的切削显微成像实现生物组织三维超分辨成像中的应用。通过本专利技术所构思的以上技术方案，与现有技术相比，通过向生物组织与膨胀物质进行膨胀处理，然后对膨胀后的生物样本进行逐层的切削成像，反复循环，由此获取三维超分辨数据，从而得到膨胀切削显微成像方法。本专利技术利用膨胀物质使生物组织膨胀为硬度不低于15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种膨胀切削显微成像方法，其特征在于，该方法是将向待成像的初始生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使所述初始生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，然后结合机械切削对该膨胀组织进行切削和显微成像，从而实现生物组织的三维膨胀切削显微成像，获取三维超分辨数据，实现三维超分辨成像。

【技术特征摘要】
1.一种膨胀切削显微成像方法，其特征在于，该方法是将向待成像的初始生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使所述初始生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，然后结合机械切削对该膨胀组织进行切削和显微成像，从而实现生物组织的三维膨胀切削显微成像，获取三维超分辨数据，实现三维超分辨成像。2.如权利要求1所述膨胀切削显微成像方法，其特征在于，所述膨胀物质为超吸水水凝胶，所述初始生物组织与所述超吸水水凝胶交联聚合后吸水膨胀形成硬度不低于15KPa的凝胶块，该凝胶块即为膨胀组织；所述超吸水水凝胶的吸水后膨胀倍数≥2倍，优选为≥4倍。3.如权利要求2所述膨胀切削显微成像方法，其特征在于，所述将向待成像的初始生物组织施加膨胀物质，在该膨胀物质的作用下使所述初始生物组织膨胀成硬度不低于15KPa的膨胀组织，具体包括以下步骤：(1)组织锚定：将荧光标记的生物组织使用甲基丙烯酸N-羟琥珀酸亚胺酯(MA-NHS)或者6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯(AcX)对生物组织中蛋白质进行锚定；(2)水凝胶渗透：将步骤(1)中获得的锚定后的生物组织置于配制完成的超吸水水凝胶溶液中进行渗透；(3)水凝胶聚合：将步骤(2)中获得渗透后的生物样本置于聚合槽中，加入新的超吸水水凝胶溶液中，聚合槽表面进行封片，然后将聚合槽置于含有水的湿盒中，放入烘箱进行聚合；(4)蛋白酶K消化：将步骤(3)中获得聚合后的生物样本置于蛋白酶K消化液中消化；(5)去离子水中透析膨胀：将步骤(4)获得消化后的生物组织置于去离子水中透析，每隔1h换一次去离子水，重复3～5次，直至膨胀至样本体积最大。4.如权利要求1所述膨胀切削显微成像方法，其特征在于，所述结合机械切削对膨胀组织进行切削和显微成像，具体包括如下步骤：(a)以所述膨胀组织的表层作为第一层成像层，在荧光显微镜下激发成像，获得第一层的成像，然后切削掉该第一层成像层，得到一次切削后的膨胀组织；(b)将步骤(a)得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆清铭，曾绍群，陈瑞希，刘秀丽，杨雄，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42