新型多肽和利用其生产IMP的方法技术

本公开内容涉及具有输出5’‑肌苷酸的活性的新型多肽、利用所述多肽的微生物、以及利用所述微生物制备5’‑肌苷酸的方法。

New Peptides and the Method of IMP Production by Using them

【技术实现步骤摘要】
新型多肽和利用其生产IMP的方法
本公开内容涉及具有输出5’-肌苷酸(IMP)活性的新型蛋白质变体、使用该多肽的微生物以及使用该微生物制备IMP的方法。
技术介绍
5’-肌苷酸(以下称为IMP)，是一种核酸物质，是核酸生物合成代谢途径的中间体，并且用于多种领域如药品和各种医疗应用等。特别地，IMP与5’-鸟嘌呤单磷酸(以下称为GMP)一起被广泛用作食品调味品添加剂或食品。虽然已知IMP本身具有牛肉味道，但也已知的是其增强了谷氨酸一钠(MSG)的风味；因此，IMP作为一种基于核酸的增味调味品正引起诸多关注。用于生产IMP的方法的例子包括对从酵母细胞提取的核糖核酸进行酶促降解的方法(日本专利公开第1614/1957号)、对通过发酵产生的肌苷进行化学磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.，36，1511，(1972)，等)、以及培养可以直接产生IMP的微生物并在培养液中回收IMP的方法等。在这些方法中，目前最常用的方法是使用能够直接生产IMP的微生物的方法。同时，由于酶在工业应用中所需的活性、稳定性、光学异构体的底物特异性等方面并不总是表现出最佳的天然性能，所以已经进行了各种尝试以通过突变它们的氨基酸序列来改进酶，以适应预期用途，等等。在这些尝试中，虽然已经应用酶的合理设计和定点诱变来改善酶功能，但在许多情况下，这些尝试显示出不利之处在于关于靶酶结构的信息不足或结构-功能相关性不明确，从而阻碍了它们的有效应用。在这一点上，之前报道了一种通过定向进化尝试增强酶来改善酶活性的方法，该方法用于从通过酶基因随机诱变构建的修饰酶文库筛选期望性状的酶。为了通过微生物发酵直接生产IMP来以高产率生产IMP，必要的是顺利进行IMP输出。为了实现本公开内容的目的，本公开内容的专利技术人已经进行了广泛的研究，并且结果已经识别了参与输出IMP活动的蛋白质，并且还发现了具有较高的IMP输出活性的蛋白质变体，从而完成本公开内容。
技术实现思路
[技术问题]本公开内容的一个目的是提供具有输出IMP活性的蛋白质变体。本公开内容的另一目的是提供编码蛋白质变体的多核苷酸。本公开内容的又一目的是提供包含所述多核苷酸的载体。本公开内容的又一目的是提供产生IMP的微生物，其中所述微生物包括蛋白质变体或包含多核苷酸的载体。本公开内容的又一目的是提供一种制备IMP的方法，其包括在培养基中培养微生物并从微生物或培养基中回收IMP。[技术解决方案]在下文中，将详细描述本公开内容。同时，本公开内容中公开的每个说明和示例性实施方案可以分别应用于其他各自的说明和示例性实施方案。即，本文公开的各种要素的所有组合均属于本公开内容的范围内。此外，以下提供的具体公开内容不应限制本公开内容的范围。为了实现上述目的，本公开内容的一个方面是提供一种具有输出IMP活性的蛋白质变体。如本文所用的，术语“输出5’-肌苷酸(IMP)的蛋白质”是指参与IMP的胞外输出的蛋白质。对于本公开内容的目的，该术语可与具有输出IMP的活性的蛋白质、IMP输出蛋白质、具有输出5’-肌苷酸的活性的蛋白质、5’-肌苷酸输出蛋白质等互换使用；具体地，该术语可以表示为ImpE，更具体地为ImpE1、ImpE2等，并且甚至更具体地为ImpE2，但不限于此。另外，蛋白质可以来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物，具体地来自停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis)，但所述微生物不限于此。例如，该蛋白质可以由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列组成，但可以包括具有与该蛋白质相同的活性的任何序列而没有限制，并且本领域技术人员可以从众所周知的数据库NCBI的GenBank获得序列信息。另外，该蛋白质可以包括SEQIDNO：2的氨基酸序列或与其具有至少80％或更高同源性的氨基酸序列，但该序列不限于此。具体而言，输出IMP的蛋白质可以包含SEQIDNO：2的多肽、或与SEQIDNO：2的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽。另外，明显的是，在本公开内容范围内可以包括具有部分序列缺失、突变、置换或增加的氨基酸序列的任何蛋白质，只要其氨基酸序列具有上述同源性并具有对应于该蛋白质的效果即可。另外，基于密码子简并性，明显的是，在本公开范围内还可以包括由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的蛋白质或可以被翻译成与前述蛋白质具有同源性的蛋白质的多核苷酸。例如，多核苷酸可以由SEQIDNO：4表示的多核苷酸序列组成。另外，在本公开范围内还可以包括以下序列而没有限制：对具有由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的蛋白质的活性的蛋白质进行编码的任何序列，其可以通过在严格条件下与可由已知基因序列制备的探针杂交来确定，所述探针例如与上述核苷酸序列的全部或部分的互补序列。术语“严格条件”是指其中使多核苷酸之间的特异性杂交成为可能的条件。这些条件在参考文献中具体描述(例如，J.Sambrook等，同上)。例如，该条件可以包括在具有高同源性、40％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地97％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性的基因之间进行杂交，而在同源性低于上述同源性的基因之间不进行杂交；或在用于Southern杂交的60℃、1×SSC和0.1％SDS、具体地在对应于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS和更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下的常规洗涤条件下进行一次、具体地两次或三次杂交。杂交需要两个核酸具有互补序列，但是碱基之间的错配也是可能的，其取决于杂交的严格性。术语“互补”用于描述可互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。相应地，本公开内容还可以包括与整个序列互补的分离核酸片段以及基本相似的核酸序列。具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件和使用上述条件的在55℃的Tm值下检测具有同源性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但是不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据预期目的适当地调整。适合于多核苷酸杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且相关变量在本领域中是公知的(参见Sambrook等，同上，9.50至9.51和11.7至11.8)。如本文所用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。同源性是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性程度，并且可以表示为百分比。在本公开内容中，具有与给定氨基酸序列或多核苷酸序列相同或相似活性的同源序列可以用“同源性％”表示。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域已知的技术来确定。例如，可以使用用于计算参数例如分数、同一性和相似性的标准软件，特别是BLAST2.0，或者通过在限定的严格条件下通过Southern杂交实验比较序列来确认同源性，并且待确定的合适杂交条件在相应技术的范围内并且可以通过本领域普通技术人员已知的方法来确定(例如J.Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratorypress，ColdSpringHarbor，纽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有输出5’‑肌苷酸的活性的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中具有以下置换：其中第123位氨基酸被半胱氨酸置换；第243位氨基酸被缬氨酸置换；第387位氨基酸被苏氨酸置换；第405位氨基酸被酪氨酸置换；第413位氨基酸被苏氨酸置换；或第458位氨基酸被赖氨酸置换；或其组合。

【技术特征摘要】
2018.01.04 KR 10-2018-00013991.一种具有输出5’-肌苷酸的活性的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体在SEQIDNO：2的氨基酸序列中具有以下置换：其中第123位氨基酸被半胱氨酸置换；第243位氨基酸被缬氨酸置换；第387位氨基酸被苏氨酸置换；第405位氨基酸被酪氨酸置换；第413位氨基酸被苏氨酸置换；或第458位氨基酸被赖氨酸置换；或其组合。2.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体是如下蛋白质变体：其中SEQIDNO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸被异亮氨酸置换；或SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁镇雅，尹炳勋，朴素静，白珉知，李智惠，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR