一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法，属于生物化学分析技术领域。本发明专利技术的方法通过测定血液中的NNN直接代谢产物及肝脏组织内NNN的间接代谢产物，在获得NNN及其代谢物的入体循环相对量的基础上，分别根据血液中α‑羟基化代谢途径产物总量与进入体循环的NNN相对量的比值和主要代谢器官内代表性DNA加合物的产量来评价NNN暴露后在不同个体内的α‑羟基化反应程度。本发明专利技术的方法评价结果准确、可靠，具有可比性，开创了一种新的可用于NNN早期暴露风险评估的方法。

A METHOD FOR DETERMINING THE CONTENT OF NNN METABOLITES IN LIVER TISSUE AND PREDICTING THE RISK OF NNN EXPOSURE

【技术实现步骤摘要】
一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法
本专利技术涉及一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量及预测NNN暴露风险的方法，属于生物化学分析

技术介绍
TSNAs是烟草中特有的N-亚硝胺类有害成分，其中N’-亚硝基降烟碱(NNN)还被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类人体致癌物质，其具有强烈的器官致癌活性，如与肺癌、胰腺癌等癌症的发生有关。目前认为，TSNAs的致癌作用是通过其在生物体内的代谢活化而产生的，因此研究TSNAs在生物体内的代谢历程显得尤为必要。研究表明，NNN在机体内的代谢主要有三种途径，第一种是吡啶-N-氧化，第二种是吡啶环的羟基化(包括在2’和5’位置的α-羟基化)，第三种是去甲基可替宁的形成。虽然目前关于形成去甲基可替宁的作用说法不一，但与另一种研究较多的重要TSNAs——4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)类似，NNN的吡啶-N-氧化代谢途径是解毒过程，而其α-羟基化代谢途径被认为是致毒过程。NNN通过2’位置的羟基化代谢途径生成不稳定的中间体—2’-羟基NNN，此中间体可以自发脱去一个HONO生成麦斯明(Myosmine)，也可以自发开环形成不稳定的吡啶氧丁基重氮氢氧化物，这种不稳定的吡啶氧丁基重氮氢氧化物可以攻击DNA生成相对稳定的POB-DNA加合物(如O2-POB-dT)，同时也可以与水反应最终生成PBD、HPB和OPBA，三者的总生成量可以反映NNN进行2’-羟基化代谢途径的程度；NNN通过5’位置的羟基化代谢途径生成不稳定的中间体—5’-羟基NNN，随后自发开环形成不稳定的叠氮氢氧化物，也能与水反应生成内半缩醛，内半缩醛经过进一步转化转变为HPBA。总的来说，PBD、HPB、OPBA和HPBA是NNN的α-羟基化途径主要代谢产物。虽然NNN的代谢途径及致癌效应较为清楚，但是目前有关NNN的研究主要集中于采用体外或体内模型直接考察NNN暴露后的毒理学机理，或停留于描述NNN在不同生物模型中的代谢特征。现有技术中，授权公告号为CN102445510B的中国专利技术专利公开了一种测定肝微粒体中NNK代谢物的液质联用方法，该方法包括步骤：(1)肝微粒体孵育：在离心管中依次加入孵育液B、孵育液A、NNK，补加磷酸盐缓冲液配制成肝微粒体孵育体系；反应：将离心管置于水浴中加热，加入肝微粒体，混合均匀后，静置反应30min；(2)样品处理：取出反应产物，加入预冷的内标乙腈溶液终止反应，放入4℃冰箱中保存60min使蛋白沉淀，3500rpm离心10min，取上清液于10000rpm离心5min，过滤；(3)液相-质谱联用测试。该方法前处理简单、分析速度快，可比较NNK在不同种属肝微粒体中的代谢。目前现有技术中并没有建立从代谢分析角度直接评估NNN潜在致毒活性的量化指标，根据量化指标评价NNN暴露风险的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种预测NNN暴露风险的方法。该方法从代谢分析角度直接评价了NNN的暴露风险。本专利技术还提供一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量的方法。该方法为评价NNN的潜在暴露风险提供基础。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种预测NNN暴露风险的方法，包括如下步骤：(1)将肝脏组织进行水解、孵育，然后固液分离；(2)将步骤(1)固液分离后的液体过固相萃取柱，洗脱，洗脱液除去溶剂得到固体样品；(3)将步骤(2)得到的固体样品用乙腈溶解得到测试样品，将测试样品采用液相色谱-质谱联用法测试分析O2-POB-dT含量；(4)根据肝脏组织中O2-POB-dT含量确定NNN在动物体内的代谢程度，并预测NNN对动物体的暴露风险。该方法为采用终点法毒理学试验从生物学效应角度进行NNN的风险评估提供了有益补充，建立了从代谢分析角度直接评估NNN潜在致毒活性的量化指标，并可以量化不同条件下的动物模型NNN暴露后的α-羟基化代谢程度，其评价结果准确、可靠，为TSNAs的风险评估提供了重要参考。预测NNN暴露风险的方法中，步骤(1)所述的水解是在酸溶液进行水解。在酸溶液中水解可以改变细胞膜的通透性，使染色体中的DNA与蛋白质分离。预测NNN暴露风险的方法中，步骤(1)所述的孵育是在80℃水浴中孵育30min，在80℃水浴中孵育30min可以使DNA水解更彻底。预测NNN暴露风险的方法中，步骤(1)所述的固液分离是使用0.22μm的有机相针式滤膜过滤。过滤后的样品可满足液质上样检测要求。预测NNN暴露风险的方法，还包括如下步骤：测定动物血液样品中NNN的α-羟基化途径代谢产物的含量，并结合动物肝脏中O2-POB-dT含量，确定NNN在动物体内的代谢程度，并预测NNN对动物体的暴露风险。利用动物血液样品中NNN的α-羟基化途径代谢的直接产物含量和动物肝脏中间接产物O2-POB-dT含量的双重指标来反映NNN在机体内的α-羟基化反应程度，其分析结果准确可靠，并使得分析评价NNN在不同机体内的α-羟基化代谢程度具有可比性。预测NNN暴露风险的方法中，所述过固相萃取柱的上样速度为1～2mL/min。1～2mL/min的上样速度可以使待测组分与填料充分作用，速度过快会导致吸附不完全，样品回收率降低。预测NNN暴露风险的方法中，步骤(2)所述的洗脱溶剂为甲醇或甲醇水溶液。甲醇可以使水接触载体的量降低，避免硅胶碎裂，水可以调节保留时间，使待测组分晚些出峰，进而达到很好的分离效果。预测NNN暴露风险的方法中，所述液相色谱的条件为：AgilentZorbaxEclipseXDB-C18色谱柱；柱温50℃；流动相A为体积分数为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，二者体积比为A：B＝32：68；等度洗脱，流速0.25mL/min；进样量10μL。预测NNN暴露风险的方法中，所述质谱的条件为：电加热喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用FullMS/ddMS2，一级全扫描分辨率为70000，范围为100～400m/z，自动增益控制为1e6，离子最大注入时间为50ms；二级扫描为数据依赖扫描，分辨率为17500，AGC为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量为35％。一种测定肝脏组织中NNN代谢产物含量的方法，包括如下步骤：(1)将肝脏组织进行水解、孵育，然后固液分离；(2)将步骤(1)固液分离后的液体过固相萃取柱，洗脱，洗脱液除去溶剂得到固体样品；(3)将步骤(2)得到的固体样品用乙腈溶解得到测试样品，将测试样品采用液相色谱-质谱联用法测试分析O2-POB-dT含量。通过该方法测定的代谢产物含量准确，为进一步评价NNN潜在暴露风险提供了可靠的量化指标。附图说明图1为本专利技术预测NNN暴露风险的方法的实施例1的家兔血液中NNN的浓度-时间变化关系图；图2为本专利技术预测NNN暴露风险的方法的实施例1的家兔血液中HPB的浓度-时间变化关系图；图3为本专利技术预测NNN暴露风险的方法的实施例1的家兔血液中PBD的浓度-时间变化关系图；图4为本专利技术预测NNN暴露风险的方法的实施例1的家兔血液中OPBA的浓度-时间变化关系图；图5为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将肝脏组织进行水解、孵育，然后固液分离；(2)将步骤(1)固液分离后的液体过固相萃取柱，洗脱，洗脱液除去溶剂得到固体样品；(3)将步骤(2)得到的固体样品用乙腈溶解得到测试样品，将测试样品采用液相色谱‑质谱联用法测试分析O

【技术特征摘要】
1.一种预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将肝脏组织进行水解、孵育，然后固液分离；(2)将步骤(1)固液分离后的液体过固相萃取柱，洗脱，洗脱液除去溶剂得到固体样品；(3)将步骤(2)得到的固体样品用乙腈溶解得到测试样品，将测试样品采用液相色谱-质谱联用法测试分析O2-POB-dT含量；(4)根据肝脏组织中O2-POB-dT含量确定NNN在动物体内的代谢程度，并预测NNN对动物体的暴露风险。2.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：步骤(1)所述的水解是在酸溶液中水解。3.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：步骤(1)所述的孵育是在80℃水浴中孵育30min。4.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：步骤(1)所述的固液分离是使用0.22μm的有机相针式滤膜过滤。5.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：还包括如下步骤：测定动物血液样品中NNN的α-羟基化途径代谢产物的含量，计算α-羟基化系数，并结合动物肝脏中O2-POB-dT含量，确定NNN在动物体内的代谢程度，并预测NNN对动物体的暴露风险。6.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的方法，其特征在于：所述过固相萃取柱的上样速度为1～2mL/min。7.根据权利要求1所述的预测NNN暴露风险的...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛健，张建勋，张启东，柴国璧，刘俊辉，宋瑜冰，史清照，范武，席辉，孙世豪，洪广峰，宗永立，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41