利用粘红酵母生产酪醇的方法技术

本发明专利技术属于酪醇生产技术领域，提供了一种用粘红酵母生产酪醇的方法，将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为4％‑10％接种至培养基中；在28‑32℃条件下进行摇床发酵，转速为100～180r/min，培养12～16h；然后添加质量浓度为2％的L‑苯丙氨酸溶液，每次添加溶液体积为培养基体积的5％，添加次数为2～4次，相邻两次添加的时间间隔在20～30h，温度降至20～25℃发酵，发酵40～120h；发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干物质中加甲醇溶液萃取6～12h；萃取液离心除杂，上清液浓缩；浓缩液经硅胶柱层析和薄层色谱检测，收集主斑点为酪醇的洗脱液重结晶得酪醇产品。本发明专利技术利用粘红酵母菌生物合成酪醇，周期短，可实现连续生产，生产方法简单，高效。

Production of tyrosol by Rhodotorula glutinosa

【技术实现步骤摘要】
利用粘红酵母生产酪醇的方法
本专利技术涉及一种酪醇的微生物生产方法，特别涉及一种利用粘红酵母生产酪醇的方法。
技术介绍
酪醇(对羟基苯乙醇，p-tyrosol)，属于典型的苯酚类天然抗氧化剂，是药用红景天植物的有效成分之一，其本身具有预防心血管、抗肿瘤、抗炎及抗敏等活性，也可以作为前体化合物用来制备具有治疗高血压、心衰竭和防癌等疗效的药物。随着人们对其药理作用的认识不断深入，其市场需求量日益增长，而且消费者更关注于其是否属于生物源。目前，酪醇的生产方法主要依靠红景天植物提取或化学合成法，如江苏中康药物科技有限公司公开的“酪醇及酪醇副产红景天苷植物提取物及其制剂与用途”(专利申请号：200610096054.8)、沈阳药科大学公开的“以对溴酚为原料经苄基保护、烃化、脱苄基制得酪醇”的方法(中国药物化学杂志，2002年)和2012年《广东化工》报道“以苯酚及其衍生物和苯乙醇为原料合成酪醇”等。近年来，人们开始关注微生物法生产酪醇的方法，如中国科学院天津工业生物技术研究所公开了“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”(专利申请号：201310133238.7)，而利用粘红酵母合成酪醇的方法至今未见报道。粘红酵母因具有酪醇合成密切相关的苯丙烷类代谢途径，并且其苯丙氨酸解氨酶PAL活性很高，是合成酪醇的潜力菌株。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供粘红酵母生产酪醇的方法。以粘红酵母菌为生产酪醇的菌种，通过发酵调控和分离提取获得酪醇。根据本专利技术提供的一种用粘红酵母菌生产酪醇的方法，所述用粘红酵母菌生产酪醇的方法具体包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为4～10％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖20～60g、酵母粉1～2g、磷酸二氢钾5～8g、硫酸铵1～3g、硫酸钠1～3g、硫酸镁0.2～0.5g，余量为水；(2)、接种后在温度为28～32℃，转速为100～180r/min下培养12～16h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L-苯丙氨酸，添加量为所述步骤(1)培养基每1000ml中添加2～5g，添加后发酵40～120h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入相当于发酵液体积10～30％的甲醇溶液，在温度为15～30℃，转速为30～60r/min下萃取6～12h；(5)、将所述步骤(4)的萃取液在温度为2～8℃，转速为4000～8000r/min下进行离心除杂，留上清液浓缩，得初产物。(6)、将所述步骤(5)的初产物经硅胶层析梯度洗脱，薄层色谱检测收集主斑点为酪醇的洗脱液重结晶得白色片状酪醇产物。优选地，所述步骤(3)添加的L-苯丙氨酸是质量浓度为2％溶液，添加次数为2～5次，每次添加的时间间隔在20～30h。优选地，所述添加L-苯丙氨酸溶液后，发酵温度降至20～25℃。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1本实施例提供的一种用粘红酵母菌生产酪醇的方法，所述用粘红酵母菌生产酪醇的方法具体包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为4％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖20g、酵母粉1g，磷酸二氢钾5g、硫酸铵1g、硫酸钠1g、硫酸镁0.2g，余量为水；(2)、接种后在温度为28℃，转速为100r/min下培养16h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L-苯丙氨酸2g，添加后发酵40h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入相当于发酵液体积10％的甲醇溶液，在温度为15℃，转速为60r/min下萃取6h；(5)、将所述步骤(4)的萃取液在温度为2℃，转速为4000r/min下进行离心除杂，留上清液浓缩，得初产物。(6)、将所述步骤(5)的初产物经硅胶层析梯度洗脱，薄层色谱检测收集主斑点为酪醇的洗脱液重结晶得白色片状酪醇产物。所述步骤(3)添加的L-苯丙氨酸是质量浓度为2％溶液，添加次数为2次，每次添加的时间间隔在20～30h。所述添加L-苯丙氨酸溶液后，发酵温度降至20℃。实施例2本实施例提供的一种用粘红酵母菌生产酪醇的方法，所述用粘红酵母菌生产酪醇的方法具体包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为10％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖60g、酵母粉2g，磷酸二氢钾8g、硫酸铵3g、硫酸钠3g、硫酸镁0.5g，余量为水；(2)、接种后在温度为32℃，转速为180r/min下培养16h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L-苯丙氨酸，添加量为所述步骤(1)培养基每1000ml中添加5g，添加后发酵120h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入相当于发酵液体积20％的甲醇溶液，在温度为30℃，转速为30r/min下萃取12h；(5)、将所述步骤(4)的萃取液在温度为8℃，转速为8000r/min下进行离心除杂，留上清液浓缩，得初产物。(6)、将所述步骤(5)的初产物经硅胶层析梯度洗脱，薄层色谱检测收集主斑点为酪醇的洗脱液重结晶得白色片状酪醇产物。所述步骤(3)添加的L-苯丙氨酸是质量浓度为2％溶液，添加次数为5次，每次添加的时间间隔在24h。所述添加L-苯丙氨酸溶液后，发酵温度降至25℃。实施例3本实施例提供的一种用粘红酵母菌生产酪醇的方法，所述用粘红酵母菌生产酪醇的方法具体包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为6％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖40g、酵母粉1.5g、磷酸二氢钾6g、硫酸铵2g、硫酸钠2g、硫酸镁0.3g，余量为水；(2)、接种后在温度为30℃，转速为140r/min下培养14h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L-苯丙氨酸，添加量为所述步骤(1)培养基每1000ml中添加3g，添加后发酵90h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入相当于发酵液体积30％的甲醇溶液，在温度为25℃，转速为40r/min下萃取10h；(5)、将所述步骤(4)的萃取液在温度为4℃，转速为5000r/min下进行离心除杂，留上清液浓缩，得初产物。(6)、将所述步骤(5)的初产物经硅胶层析梯度洗脱，薄层色谱检测收集主斑点为酪醇的洗脱液重结晶得白色片状酪醇产物。所述步骤(3)添加的L-苯丙氨酸是质量浓度为2％溶液，添加次数为3次，每次添加的时间间隔在30h。所述添加L-苯丙氨酸溶液后，发酵温度降至24℃。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用粘红酵母生产酪醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)按照接种量为4～10％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖20～60g、酵母粉1～2g、磷酸二氢钾5～8g、硫酸铵1～3g、硫酸钠1～3g、硫酸镁0.2～0.5g，余量为水，该培养基的pH值在5～7之间；(2)、接种后在温度为28～32℃，转速为100～180r/min下培养12～16h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L‑苯丙氨酸溶液，添加量为所述步骤(1)培养基质量分数为2～8％，添加后发酵40～96h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入相当于发酵液体积10～30％的甲醇溶液，在温度为15～30℃，转速为30～60r/min下萃取6～12h；(5)、将所述步骤(4)的萃取液在温度为2～8℃，转速为4000～8000r/min下进行离心除杂，留上清液浓缩，得初产物。(6)、将所述步骤(5)的初产物经硅胶层析梯度洗脱，薄层色谱检测收集主斑点为酪醇的滴唾液重结晶得白色片状酪醇产物。

【技术特征摘要】
1.一种用粘红酵母生产酪醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)、将粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)按照接种量为4～10％接种至培养基中，每1000ml培养基包括如下原料：葡萄糖20～60g、酵母粉1～2g、磷酸二氢钾5～8g、硫酸铵1～3g、硫酸钠1～3g、硫酸镁0.2～0.5g，余量为水，该培养基的pH值在5～7之间；(2)、接种后在温度为28～32℃，转速为100～180r/min下培养12～16h；(3)、向所述步骤(2)的培养液中添加L-苯丙氨酸溶液，添加量为所述步骤(1)培养基质量分数为2～8％，添加后发酵40～96h；(4)、发酵完成后将发酵液进行真空冻干处理，向冻干后的物质中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛飞燕，于跃，马兰青，杨明峰，韦春，刘子慧，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11