低温几丁质酶基因chiC在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法技术

本发明专利技术涉及基因工程、微生物学、酶工程、及发酵工程领域，提供了一种低温几丁质酶基因chiC(chitinase C)在乳酸克鲁维酵母中克隆表达纯化的方法。本发明专利技术方法，成功构建产低温几丁质酶chiC的重组乳酸克鲁为酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶chiC，利用镍柱亲和层析纯化得到较纯的重组几丁质酶chiC，经SDS‑PAGE分析在90kDa附近出现符合预期大小的蛋白条带。本发明专利技术使得表达的几丁质酶chiC大部分分泌到细胞外，从而降低了分离纯化成本，提高了表达效率。纯化蛋白chiC的蛋白浓度为1.48mg/mL，酶活力为108.56U/mg。本发明专利技术对纯化后的几丁质酶ChiC进行了温度及温度稳定性、pH及pH稳定性、协同降解作用等酶学性质研究，为该酶的工业化应用奠定了基础。

Expression and purification of chitinase gene chiC in Kluyveromyces lactis

【技术实现步骤摘要】
低温几丁质酶基因chiC在乳酸克鲁维酵母中的表达纯化方法
本专利技术涉及基因工程、微生物学、酶工程、及发酵工程领域，提供了一种低温几丁质酶基因chiC(chitinaseC)在乳酸克鲁维酵母中克隆表达纯化的方法。
技术介绍
几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的多糖，是海洋环境含量最丰富的可再生资源，其降解主要通过海洋微生物分泌的几丁质酶降解体系完成。其中几丁质酶ChiC是其中一种关键酶，它能把多糖的骨架降解成短链的寡糖。几丁质酶降解几丁质产生的高附加值几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物，具有良好的组织兼容性、生物降解性以及调节免疫力、抗菌、诱导植物抗病性、促进植物生长和抗癌等生物活性，在医药行业、食品工业、农业和养殖业等领域有着广泛的应用前景。低温几丁质酶ChiC编码基因为chiC，其GenBank登录号为No.KF234017，该基因属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)。目前，已有在大肠杆菌中表达来源于假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)几丁质酶chiC基因的报道，虽然目的基因表达量高，但产物主要集中在细胞内，使得后续的分离纯化成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温几丁质酶基因chiC的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建pKLAC2‑chiC表达载体；(2)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达低温几丁质酶基因chiC的工程菌；(3)培养上述工程菌，诱导低温几丁质酶基因chiC表达；(4)诱导表达后纯化，获得所需重组蛋白ChiC。

【技术特征摘要】
1.一种低温几丁质酶基因chiC的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建pKLAC2-chiC表达载体；(2)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达低温几丁质酶基因chiC的工程菌；(3)培养上述工程菌，诱导低温几丁质酶基因chiC表达；(4)诱导表达后纯化，获得所需重组蛋白ChiC。2.如权利要求1所述的一种低温几丁质酶基因chiC的表达纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：①以优化后opt-chiC的基因序列为模板，以opt-chiC-F引物和opt-chiC-R引物对进行PCR扩增；②将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD19-T-chiC；③将质粒pMD19-T-chiC转化至大肠杆菌JM109感受态细胞培养，筛选阳性转化子，用XhoI和EcoRI酶切验证并测序正确后连接到载体pKLAC2，得到pKLAC2-chiC。3.如权利要求2所述的一种低温几丁质酶基因chiC的表达纯化方法，其特征在于，所述优化后opt-chiC的基因序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求2所述的一种低温几丁质酶基因chiC的表达纯化方法，其特征在于，所述引物opt-chiC-F：5’–CCGCTCGAGAAAAGAATGTCCTCCAGAAAGATC-3’；opt-chiC-R：5’–...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立功，王文毫，王晓辉，迟乃玉，张庆芳，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21