一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。该方法包括：采用MALDI‑TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；采用mascot搜索引擎将MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1进行比对，如果MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果MALDI指纹图谱与SEQ ID No.1匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。该方法操作简便，可快速准确地鉴别耐药菌和敏感菌，整个流程不超过10分钟，具有耗时短、灵敏度高、特异性高的优点，可为临床治疗由该类细菌引起的严重感染争取宝贵的时间。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法
本专利技术属于医药检测
，特别涉及一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。
技术介绍
自1928年英国科学家亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，抗菌药物的应用使得全球每年有数千万人受益。随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌不断涌现，“超级细菌”的产生和快速传播使得细菌耐药已成为国内、外高度关注的重大公共卫生问题之一。高效、便捷、实用性强的耐药细菌检测方法对于大规模监测细菌耐药、探究耐药机制、防控耐药细菌流行传播十分重要。细菌药物敏感性试验是目前国内、外临床和实验室最常用的细菌耐药性检测方法，有纸片法、琼脂稀释法、肉汤稀释法、浓度梯度法等，其中除纸片法外，其余方法均可以获得相对精确的药物最低抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)。近十几年来，借助工业技术的创新，已出现商品化自动药敏检测及分析系统，由于其操作流程的自动化和标准化，目前广泛应用于临床抗感染诊断和治疗以及基层实验室细菌耐药性的日常检测。上述这些方法经典稳定，但都有各自的局限性。一方面上述几种方法操作繁琐、时间长、灵敏度低、特异性差、整个过程影响因素较多；另一方面药物选择的灵活性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的方法。本专利技术所提供的鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，具体可包括如下步骤：(a)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；(b)采用mascot搜索引擎，将步骤(a)获得的所述MALDI指纹图谱与79AA特征序列进行比对，所述79AA特征序列如SEQIDNo.1所示，根据比对结果按照如下确定所述待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株(即为或候选为药物敏感菌株)。其中，采用mascot搜索引擎将所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列进行比对后，若所得菌株鉴定分值大于等于50分，视为所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配；若所得菌株鉴定分值小于50分，视为所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配。在步骤(a)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上培养成单菌落(35℃培养24h)；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。进一步地，所述基质可为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。其中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。更大范围地，本专利技术所提供的鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，可包括如下步骤：鉴定所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中是否含有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中不含有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述待测金黄色葡萄球菌的蛋白质组中含有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株(即为或候选为药物敏感菌株)。本专利技术还保护氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的多肽。当然，所述多肽在作为标记用于鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药中的应用也属于本专利技术的保护范围。另外，本专利技术还要求保护一种将待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否进行分组的方法。本专利技术所提供的将待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否进行分组的方法，具体可包括如下步骤：(A)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测，获得各自的MALDI指纹图谱；(B)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述MALDI指纹图谱分别与Biotyper3.0软件中的数据库进行比对，确定种属并获得匹配分值；(C)将步骤(A)获得的所有待测金黄色葡萄球菌的所述匹配分值基于PearsonCorrelation做分值的分层聚类统计分析，从而将所述待测金黄色葡萄球菌菌群按照耐药与否分为两组。在步骤(A)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体分别接种到固体培养基上培养成单菌落(35℃培养24h)；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。进一步地，所述基质可为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。其中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌菌群中的所有个体进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200～20000m/z。在本专利技术中，以上所述的耐药均具体可为耐甲氧西林。在本专利技术中，应用MALDI-TOF/TOF质谱技术检测金黄色葡萄球菌耐药菌和敏感菌，通过对10例耐药菌和10例敏感菌的谱图比对，找出特征的氨基酸序列(SEQIDNo.1)作为耐药性的新判定标准。该方法操作简便、在严格控制实验条件的情况下，可快速准确地鉴别耐药菌和敏感菌，整个流程不超过10分钟，具有耗时短、灵敏度高、特异性高的优点，可为临床治疗由该类细菌引起的严重感染争取宝贵的时间。附图说明图1为根据匹配分值聚类分析MRSA组和MSSA组，能明显看到两组区别(四次重复，**p<0.01)。图中，OQ、OE、OS、OT表示四次重复。图2为指纹图谱峰值统计后，ClinProTools3.0软件将两组图谱计算的二维分析图(注：×代表MRSA，△代表MSSA，圈代表两组聚集的倾向)。图3为通过分别比对MRSA组和MSSA组的指纹比图，发现指示其变化的特征耐药氨基酸序列，并与Biotyper打分系统相互对应。图4为从样本中随机挑选菌株验证本方法的准确性。图中，OQ、OE、OS、OT表示四次重复，R1和R2是MRSA(耐药菌株)合集，R3和R4是MSSA(敏感菌株)合集。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、鉴定金黄色葡萄球菌是否耐药的新方法一、材料菌株来源：北京中医药大学附属东直门医院临床分离的10株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和10株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株用于建模和验证。试剂：三氟乙酸、乙腈(Thermofisher,美国)、96孔加样板、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、多肽标准品(MALDI-TOF/TOF质谱仪校正的时候用的多肽标准品，属于Bruker这款仪器自带的校正标品)。仪器：MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker，德国)、二氧化碳培养箱(Thermo371，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)。软件：MALDIBiotype本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，包括如下步骤：(a)采用MALDI‑TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；(b)采用mascot搜索引擎，将步骤(a)获得的所述MALDI指纹图谱与79AA特征序列进行比对，所述79AA特征序列如SEQ ID No.1所示，根据比对结果按照如下确定所述待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定待测金黄色葡萄球菌是否耐药的方法，包括如下步骤：(a)采用MALDI-TOF/TOF质谱仪对待测金黄色葡萄球菌进行检测，获得MALDI指纹图谱；(b)采用mascot搜索引擎，将步骤(a)获得的所述MALDI指纹图谱与79AA特征序列进行比对，所述79AA特征序列如SEQIDNo.1所示，根据比对结果按照如下确定所述待测金黄色葡萄球菌是否耐药：如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列不匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌为或候选为耐药菌株；如果所述MALDI指纹图谱与所述79AA特征序列匹配，则所述待测金黄色葡萄球菌不为或候选不为耐药菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测前还包括如下步骤：将所述待测金黄色葡萄球菌接种到固体培养基上培养成单菌落；挑取单菌落涂布于所述MALDI-TOF/TOF质谱仪的靶盘圆点处，涂布厚度大于0mm且小于1mm；然后覆盖基质。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：采用所述MALDI-TOF/TOF质谱仪对所述待测金黄色葡萄球菌进行检测时设置参数如下：Shots为500，激光能量85％，谱图采集范围200...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贤煜，王毅，李连达，杨伟峰，姜童童，
申请(专利权)人：中国中医科学院医学实验中心，
类型：发明
国别省市：北京,11