原种事件EE-GH7以及用于在生物样品中鉴定该事件的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供特定的转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于这些产品在棉花基因组中的特定位置具有特定的除草剂耐受性转化事件。还提供工具，所述工具允许快速且明确地识别生物样品中的该事件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原种事件EE-GH7以及用于在生物样品中鉴定该事件的方法和试剂盒
本专利技术涉及新型核酸和转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于在棉花基因组的特定位置具有特定的转化事件，特别是存在编码赋予除草剂耐受性的蛋白的基因。本专利技术的棉花植物将除草剂耐受性表型与不同遗传背景中的农艺性能、遗传稳定性和功能性组合，所述遗传背景与不存在除草剂情况下相应的未转化棉花的遗传背景相当。本专利技术进一步提供用于在生物样品中鉴定包含特别是转化事件EE-GH7的植物材料的存在的方法和试剂盒。
技术介绍
植物中转基因的表型表达由该基因(一个或多个)本身的结构以及它或它们在植物基因组中的位置决定。同时，转基因或“外源DNA”在基因组不同位置的存在将以不同方式影响植物的整体表型。通过遗传操作在植物中农业上或工业上成功地引入商业上感兴趣的性状，是依赖于多种不同因素的漫长过程。遗传转化植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤中的第一步，该一系列选择步骤包括广泛的遗传表征、基因渗入和田间试验评估，最终导致选择原种事件(eliteevent)。鉴于有关新食品/饲料、GMO和非-GMO产品分离、以及专利材料鉴定方面的讨论，对原种事件的明确鉴定变得越来越重要。理想地，这种鉴定方法要既快速又简单，不需要广泛的实验室设置。此外，该方法应该提供无需专家解释也能够明确确定原种事件的结果，且该结果在必要时经得起专家审查。本文描述了用于在生物样品中鉴定原种事件EE-GH7的特定工具。在本专利技术中，EE-GH7已经在除草剂耐受性棉花(陆地棉(Gossypiumhirsutum))的开发中自一群转基因棉花植物中被鉴定为原种事件，所述原种事件包含编码草甘膦(glyphosate)耐受性的基因与赋予对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂耐受性的基因的组合，各基因在植物可表达启动子的控制下。种植双除草剂耐受性的棉花EE-GH7品种为种植者提供了使用异唑草酮(IFT)和/或草甘膦除草剂控制杂草的新选择。草甘膦广泛用于棉花和其他农业生产系统。IFT除草剂为棉花种植者提供了另一种控制杂草的选择，以帮助管理问题杂草物种，并作为一种替代作用模式工具，帮助减缓除草剂抗性杂草的传播。使用IFT，向棉花中引入了一种新的作用模式，其对目前在棉田中发现的许多杂草有效。本领域已经公开了包含除草剂耐受性基因的棉花植物。WO2007/017186描述了包含epsps基因的草甘膦耐受性棉花原种事件。WO2013/026740描述了包含在温室和田间赋予耐受性的hppd和epsps基因的棉花植物。WO2013/026740还描述了包含hppd和epsps基因的棉花植物，这两个基因被引入WO2008/151780中描述的包含昆虫抗性基因的原种事件的3'侧翼区。然而，现有技术公开的内容都没有教导或暗示这样的原种事件，所述原种事件包含编码草甘膦耐受性的基因和赋予对HPPD抑制剂耐受性的基因组合，且可以以具有或不具有昆虫抗性基因的灵活方式使用。本领域已知，在具有可接受的农艺性能(agronomicperformance)的棉花植物中获得商业除草剂耐受性原种转化事件，并且确定地对2种不同类别的除草剂提供足够的除草剂耐受性，决不是容易之事。本专利技术优选实施方案的概述本专利技术涉及转基因棉花植物或其种子、细胞或组织，其包含稳定整合到其基因组中的表达盒，所述表达盒包含含有2mEPSPS基因编码序列的除草剂耐受性基因和含有hppdPf-W336-1Pa基因编码序列的另一除草剂耐受性基因(二者如本文实施例1.1中所述，并如SEQIDNo1中所示)，所述转基因棉花植物耐受草甘膦和HPPD抑制剂除草剂(如异唑草酮)，并且在不存在(一种或多种)除草剂的情况下具有与非转基因等基因系基本等同的农艺性能。在施用一种或多种耐受性所针对的除草剂后，该植物与非转基因植物相比具有优异的农艺表型。根据本专利技术，所述棉花植物或其种子、细胞或组织包含原种事件EE-GH7。更具体地，本专利技术涉及转基因棉花植物、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于，当使用分别针对EE-GH7的5'或3'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源DNA的两个引物，在如本文所述的PCR鉴定方案中分析时，产生特异于EE-GH7的片段。引物可以分别针对SEQIDNO：1中的3'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源DNA。引物也可分别针对SEQIDNO：1中的5'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源DNA，例如引物可以包含或(基本上)由SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的核苷酸序列组成，或包含或(基本上)由SEQIDNo.5和SEQIDNo.：6的核苷酸序列组成，并产生50-1000bp的DNA片段，如约126bp或约120bp的片段。包含本专利技术原种事件的参考种子已经以保藏号PTA-122856保藏在ATCC。本专利技术的一个实施方案是保藏号为PTA-122856的包含原种事件EE-GH7的种子，其将生长为耐受除草剂的棉花植物，特别是耐受草甘膦和/或HPPD抑制剂如异唑草酮。本专利技术的一个实施方案是包含在以保藏号PTA-122856保藏的种子中的原种事件EE-GH7，其在引入棉花植物中时将提供对除草剂，特别是HPPD抑制剂如异唑草酮和对草甘膦的抗性。本专利技术包括该事件的微小变体，例如，具有HPPD抑制剂耐受性和草甘膦耐受性的棉花事件，其具有与保藏号PTA-122856保藏在ATCC的种子中所含的EE-GH7的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％序列同一性的核苷酸序列；或具有HPPD抑制剂耐受性和草甘膦耐受性的棉花事件，其具有与保藏号ATCCPTA-122856的保藏种子中所含的EE-GH7的核苷酸序列相差1至200、1至150、1至100、1至75、1至50、1至30、1至20、1至10、或1至5个核苷酸的核苷酸序列，或具有与SEQIDNo.1的核苷酸序列相差1至200、1至150、1至100、1至75、1至50、1至30、1至20、1至10、或1至5个核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，EE-GH7包含与SEQIDNo.1的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％序列同一性的核苷酸序列。ATCC保藏号PTA-122856的种子是由至少约95％的转移DNA纯合的转基因种子组成的种子批，其中所述转移DNA包含本专利技术原种事件，所述转基因种子将生长为除草剂耐受性植物，由此这些植物是耐受草甘膦和/或异唑草酮的。可以播种从保藏种子可获得的或获得的种子或后代种子(例如，与具有不同遗传背景的其他棉花植物杂交后)，并且可以如本文所述用草甘膦或异唑草酮处理生长的植物，以获得包含本专利技术原种事件的100％草甘膦或异唑草酮耐受性植物。本专利技术进一步涉及来自包含本专利技术原种事件的植物的细胞、组织、后代(progeny)和后裔(descendants)，所述植物从保藏在ATCC的保藏号PTA-122856的种子生长。本专利技术进一步涉及可从包含本专利技术原种事件的棉花植物(如从保藏在ATCC的保藏号PTA-122856的种子生长的植物)获得(如通过繁殖和/或培育)的植物。本专利技术还涉及包含原种事件EE-G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包含与SEQ ID No.1的核苷酸1207至核苷酸1228、或SEQ ID No.1的核苷酸8022至8043、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.20 US 62/324,922;2016.04.21 US 62/325,9651.一种核酸分子，其包含与SEQIDNo.1的核苷酸1207至核苷酸1228、或SEQIDNo.1的核苷酸8022至8043、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。2.一种核酸分子，其包含与SEQIDNo.1的核苷酸1197至核苷酸1238、或SEQIDNo.1的核苷酸8012至8053、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。3.一种核酸分子，其包含与SEQIDNo.1或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。4.一种核酸分子，其包含与SEQIDNo.1的核苷酸序列或其互补序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。5.一种核酸分子，其包含与SEQIDNo.1的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。6.棉花基因组DNA，其包含权利要求1至5中任一项的核酸分子。7.包含原种事件EE-GH7的棉花基因组DNA。8.包含外源DNA的嵌合DNA，其中所述外源DNA的序列由SEQIDNo.1的核苷酸1218至核苷酸8032的序列组成，其侧翼为5'和3'侧翼区，其中所述外源DNA的紧邻上游并与所述外源DNA连续的5'侧翼区的特征在于由SEQIDNo.1的核苷酸1至核苷酸1217的序列组成的序列，并且其中所述外源DNA的直接下游并与所述外源DNA连续的3'侧翼区的特征在于由SEQIDNo.1的核苷酸8033至核苷酸9328的序列组成的序列。9.棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其包含权利要求1至5中任一项的核酸分子或权利要求8的嵌合DNA。10.转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其各自在其基因组中包含原种事件EE-GH7，其中包含所述事件的参考种子已经以保藏号PTA-122856保藏在ATCC。11.根据权利要求10的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，当使用分别包含SEQID3和SEQID4的核苷酸序列的两个引物和针对EE-GH7的原种事件鉴定方案进行分析时，其基因组DNA产生约126bp的DNA片段。12.以保藏号PTA-122856保藏在ATCC的包含原种事件EE-GH7的种子或其衍生物。13.可从权利要求12的种子获得的、包含原种事件EE-GH7的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代。14.一种棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其各自在其基因组中包含原种事件EE-GH7，并且可通过繁殖和/或培育从保藏在ATCC的保藏号PTA-122856的种子生长的棉花植物获得。15.一种包含原种事件EE-GH7的棉花种子，其中包含所述事件的参考种子已经以保藏号PTA-122856保藏在ATCC。16.一种包含原种事件EE-GH7的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其可从权利要求15的种子获得。17.一种在其基因组中包含原种事件EE-GH7的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其中，如在以保藏号PTA-122856保藏在ATCC的参考种子中发现的，所述原种事件是包含插入的外源DNA和直接围绕所述插入的外源DNA的5'和3'侧翼序列的遗传基因座，所述外源DNA含有嵌合HPPDW336蛋白编码基因和嵌合2mEPSPS蛋白编码基因。18.一种在其基因组中包含事件EE-GH7的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其特征在于包含与SEQIDNo.1的核苷酸1207至核苷酸1228或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列的核酸分子、和包含与SEQIDNo.1的核苷酸8022至8043或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列的核酸分子。19.一种棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其包含EE-GH7，并且在其细胞的基因组中包含与SEQIDNo.1的核苷酸1197至核苷酸1238或所述序列的互补序列具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列、和与SEQIDNo.1的核苷酸8012至8053或所述序列的互补序列具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列。20.根据权利要求9至11、13、14和16至19中任一项的棉花植物，其耐受异唑草酮和/或草甘膦。21.根据权利要求9至20中任一项的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其还包含：-事件T304-40，其包含草铵膦耐受性和Cry1Ab基因，如WO2008/122406中所述；-事件GHB119，其包含草铵膦耐受性和Cry2Ae基因，如WO2008/151780中所述；和/或-事件COT102，其包含VIP3A基因，如WO2004/039986中所述。22.一种生产包含原种事件EE-GH7的棉花植物或种子的方法，包括将根据权利要求9至11、13、14和16至21中任一项的植物与另一棉花植物杂交，并种植从所述杂交获得的种子。23.一种生产耐受HPPD抑制剂除草剂和草甘膦的棉花植物的方法，包括：通过将缺少HPPDW336编码基因且缺少2mEPSPS编码基因的第一棉花植物与权利要求9至11、13、14和16至21中任一项的棉花植物杂交，并选择耐受HPPD抑制剂除草剂和/或草甘膦的后代植物，将HPPD抑制剂除草剂和草甘膦的耐受性引入棉花植物的基因组中。24.根据权利要求23的方法，其中通过用HPPD抑制剂除草剂和/或用草甘膦处理生长的植物来选择耐受HPPD抑制剂除草剂和/或草甘膦的所述后代植物。25.一种棉产品，其由权利要求9至21中任一项的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代生产。26.根据权利要求25的棉产品，其包含纤维、棉绒、种子、种子粉或种子油。27.根据权利要求25或26的棉产品，其中所述棉产品包含产生诊断事件EE-GH7或特异于事件EE-GH7的扩增子的核酸。28.一种生产棉产品的方法，包括获得权利要求9至21中任一项的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，并从中生产这种棉产品。29.根据权利要求28的方法，其中所述棉产品是或包含纤维、棉绒、种子、种子粉或种子油。30.根据权利要求28或29的方法，其中所述棉产品包含产生诊断事件EE-GH7或特异于事件EE-GH7的扩增子的核酸。31.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗之前但在种子播种之后，用HPPD抑制剂除草剂处理播种了权利要求9至21中任一项的棉花种子的田地。32.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗之后用HPPD抑制剂除草剂处理权利要求9至11、13、14和16至21中任一项的棉花植物。33.一种保护权利要求9至11、13、14和16至21中任一项的出苗棉花植物免受杂草竞争的方法，包括在棉花植物种植或种子播种之前，用HPPD抑制剂除草剂处理将种植所述棉花植物的田地，然后在所述预处理的田地中种植或播种所述棉花植物或种子。34.根据权利要求31至33中任一项的方法，还包括用草甘膦处理棉花植物。35.根据权利要求31至34中任一项的方法，其中所述HPPD抑制剂除草剂是异唑草酮。36.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗后用草甘膦处理权利要求9至11、13、14和16至21中任一项的棉花植物。37.根据权利要求9至21中任一项的植物、其种子、部分、细胞或后代用于生产棉纤维的用途。38.根据权利要求9至21中任一项的棉花植物或种子用于生长HPPD抑制剂除草剂耐受性和/或草甘膦耐受性棉花植物的用途。39.根据权利要求9至21中任一项的棉花种子用于获得棉产品的用途，其中所述棉产品是或包含纤维、棉绒、种子、种子粉或种子油。40.一种鉴定生物样品中原种事件EE-GH7的方法，该方法包括用特异性引物对或探针检测EE-GH7特异性区域，所述特异性引物对或探针特异性识别EE-GH7中包含除草剂耐受性基因的外源DNA的5'或3'侧翼区、以及与所述5'或3'侧翼区连续的外源DNA部分。41.根据权利要求40的方法，所述方法包括：使用至少两个引物和聚合酶链反应，从所述生物样品中存在的核酸扩增50至1000bp的DNA片段，其中第一引物识别EE-GH7中包含除草剂耐受性基因的外源DNA的5'侧翼区，所述5'侧翼区包含SEQIDNo.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列，或其中所述第一引物识别EE-GH7中包含除草剂耐受性基因的外源DNA的3'侧翼区...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·简森斯，R·德莱森，W·阿尔特森，J·范海伦，H·莫泽，G·莱特，
申请(专利权)人：巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US