乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。该乳腺癌分型的核酸组合物包括多个扩增引物对及与多个扩增引物对对应的多种探针，各探针上均连接有荧光基团，多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对。通过探针及扩增引物对的配合，能够减少未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，提高定量结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种乳腺癌分型的核酸组合物、乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。根据福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织中的生物标志物人类表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的病理评分结果，可将乳腺癌分为四种分子亚型：腔面A型、腔面B型、HER2过表达型和三阴型乳腺癌。随着液滴数字PCR(ddPCR)近年来的迅速发展。虽然可以利用ddPCR在单个荧光通道上的探针浓度改变来区分不同的靶标基因，对乳腺癌进行分型，但这种方法一般只对片段完整的样本的准确性较高，而对片段化的DNA的准确性较低。而FFPE标本是经过福尔马林固定的石蜡样本，在此基础上提取的DNA已被高度片段化，所以目前采用ddPCR对FFPE样本进行靶基因定量时，准确性较低。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种能够提高乳腺癌分型准确性的乳腺癌分型的核酸组合物。此外，还提供一种能够提高乳腺癌分型准确性的乳腺癌分型试剂盒及其使用方法。一种乳腺癌分型的核酸组合物，包括多个扩增引物对及与所述多个扩增引物对对应的多种探针，各所述探针上均连接有荧光基团，所述多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；所述扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；所述HER2引物对的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示；所述ESR1引物对的序列如SEQIDNo.3～SEQIDNo.4所示；所述PGR引物对的序列如SEQIDNo.5～SEQIDNo.6所示。利用ddPCR在单个荧光通道上的探针浓度改变来区分不同的靶标基因时，高度片段化的DNA在PCR扩增反应中容易形成未完全扩增的液滴，这些未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，进而对结果的判读造成影响，从而影响定量结果的准确性。而上述乳腺癌分型的核酸组合物，在使用时通过多个扩增引物及对应的探针配合，能够减少未完全扩增的液滴与同一荧光通道上的其它阳性团簇互相重叠，提高定量结果的准确性。在其中一个实施例中，与所述HER2引物对、所述ESR1引物对及所述PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列分别如SEQIDNo.7～SEQIDNo.9所示。在其中一个实施例中，所述多种探针中至少一种探针具有不同浓度。在其中一个实施例中，各所述探针上连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。在其中一个实施例中，与所述HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与所述ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针，与所述PGR引物对应的探针上连接有HEX。在其中一个实施例中，与所述HER2引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM；所述第一探针的浓度为50nM～300nM，所述第二探针的浓度为50nM～300nM；与所述PGR引物对对应的探针的浓度为50nM～300nM。在其中一个实施例中，还包括参比引物对和与所述参比引物对对应的探针，与所述参比引物对应的探针上连接有荧光基团。在其中一个实施例中，所述与所述参比引物对对应的探针包括连接有FAM的第三探针及连接有HEX的第四探针，所述第三探针的浓度为50nM～300nM，所述第四探针的浓度为50nM～300nM。一种乳腺癌分型试剂盒，包括上述乳腺癌分型的核酸组合物。在其中一个实施例中，还包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、RNA提取试剂及逆转录试剂中的至少一种。一种乳腺癌分型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：提取核酸，得到核酸样本；将所述核酸样本、上述乳腺癌分型试剂盒中的扩增引物对和对应的探针混合后，制备PCR微反应液滴；将所述PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；及收集PCR扩增反应后的产物的荧光信号，得到检测结果。附图说明图1为实施例1的液滴分布图；图2为实施例2的液滴分布图；图3为实施例3的操作流程图；图4为实施例3中HER2的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；图5为实施例3中HER2的ROC曲线图；图6为实施例3中ESR1IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；图7为实施例3中ESR1ROC曲线图；图8为实施例3中PGR的IHC阳性细胞百分比与ddPCR结果对比图；图9为实施例3中PGR的ROC曲线图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的部分实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本专利技术一实施方式提供了一种乳腺癌分型的核酸组合物，包括多个扩增引物对及与多个扩增引物对对应的多种探针，各探针上均连接有荧光基团，多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同。扩增引物对用于扩增目的基因，该目的基因是能够用于乳腺癌的分型判断。比如编码人类表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的基因。在其中一个实施例中，扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对。HER2引物对用于扩增HER2。进一步地，HER2引物对的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示。其中，SEQIDNo.1的序列为：5’-ACGTTTGAGTCCATGCCCAA-3’；SEQIDNo.2的序列为：5’-GGATCCCACGTCCGTAGAA-3’。ESR1引物对用于扩增ESR1。进一步地，ESR1引物对的序列如SEQIDNo.3～SEQIDNo.4所示。其中，SEQIDNo.3的序列为：5’-ACCAACCAGTGCACCATTGA-3’；SEQIDNo.4的序列为：5’-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTT-3’。PGR引物对用于扩增PGR。进一步地，PGR引物对的序列如SEQIDNo.5～SEQIDNo.6所示。其中，SEQIDNo.5的序列为：5’-TTTCATCCACGTGCCTATCC-3’。SEQIDNo.6的序列为5’-GCCGTCGTAACTTTCGTCTT-3’。与扩增引物对对应的探针上均连接有荧光基团，各个探针上连接的荧光基团的选择无特别要求，只要每个探针上均连接有荧光基团，且所有探针上连接的荧光基团的种类至少两种即可。当然，在探针上还连接有与荧光基团对应的淬灭基团。进一步地，荧光基团位于探针的5’端，淬灭基团位于探针的3’端。在其中一个实施例中，荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。在其中一个实施例中，与HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与PGR引物对应的探针上连接有HEX，与ESR1引物对对应的探针包括连接有FAM的第一探针及连接有HEX的第二探针。第一探针与第二探针的核苷酸序列相同。在其中一个实施例中，多种探针中至少一种探针具有不同浓度。在其中一个实施例中，多种探针中至少一种探针具有不同浓度，此时，该不同浓度的探针上连接的荧光基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，包括多个扩增引物对及与所述多个扩增引物对对应的多种探针，各所述探针上均连接有荧光基团，所述多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；所述扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；所述HER2引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示；所述ESR1引物对的序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示；所述PGR引物对的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，包括多个扩增引物对及与所述多个扩增引物对对应的多种探针，各所述探针上均连接有荧光基团，所述多种探针中至少有两种探针所连接的荧光基团不同；所述扩增引物对包括HER2引物对、ESR1引物对及PGR引物对；所述HER2引物对的序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.2所示；所述ESR1引物对的序列如SEQIDNo.3～SEQIDNo.4所示；所述PGR引物对的序列如SEQIDNo.5～SEQIDNo.6所示。2.根据权利要求1所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，与所述HER2引物对、所述ESR1引物对及所述PGR引物对对应的探针的序列或其互补序列分别如SEQIDNo.7～SEQIDNo.9所示。3.根据权利要求1所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，所述多种探针中至少有一种探针具有不同浓度。4.根据权利要求1～3任一项所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，各所述探针所连接的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5及ROX中的一种。5.根据权利要求4所述的乳腺癌分型的核酸组合物，其特征在于，与所述HER2引物对对应的探针上连接有FAM，与所述ESR1引物对对应的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雯雯，郑佳莹，王纪东，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44