本发明专利技术公开了一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ‑谷氨酸产量的方法。通过在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的三个关键基因ribE、ribF和ribH，分别构建了三株FAD强化合成的菌株。在不同的液体发酵条件下，ribE、ribF和ribH过表达使甘油代谢能力比对照菌株分别至少提高了22.02％，20.62％和23.92％，这些重组菌株的聚γ‑谷氨酸产量至少是对照菌株的1.20倍，1.18倍和1.27倍。由此表明，强化FAD合成可显著提高芽胞杆菌甘油代谢，增加聚γ‑谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。
【技术实现步骤摘要】
一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法
本专利技术涉及基因工程和微生物学
，具体涉及一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法。
技术介绍
聚γ-谷氨酸是微生物发酵产生的具有多功能的高分子聚合物，由D-谷氨酸或L-谷氨酸单元通过γ-酰胺键连接而成的阴离子型化合物，具有良好的阳离子螯合、吸水保湿、无毒和可生物降解等特性，可作为药物载体、矿物营养强化剂、絮凝剂、保湿剂、肥料促进剂，用于医药、食品、水处理、化妆品及农业等领域。目前工业化生产聚γ-谷氨酸主要原料为高成本的葡萄糖和谷氨酸等，致使聚γ-谷氨酸的生产成本较高，严重制约聚γ-谷氨酸相关产业链的快速发展，必须寻求廉价易得的替代性原料。粗甘油是廉价、可再生的生物废弃资源，是非常适合用于发酵生产聚γ-谷氨酸的替代原料。芽胞杆菌属，包括地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌能够利用甘油发酵合成聚γ-谷氨酸，目前利用甘油发酵聚γ-谷氨酸技术存在着发酵周期长(甘油代谢速度慢)及生产转化率低等问题，限制了甘油的利用。因此，提高甘油代谢速率是甘油作为原料发酵生产聚γ-谷氨酸的关键因素。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是微生物细胞内核黄素的活性型，作为某些氧化还原酶的辅基，广泛参与胞内多种氧化脱氢反应，同时可以作为电子传递链传递氢的作用。其氧化型和还原型分别简写为FAD和FADH2。因此，胞内FAD合成和再生是生物催化和细胞代谢是非常重要的。在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成是以三磷酸鸟苷和核酮糖5-磷酸为前体，通过嘧啶和蝶啶中间体合成反应生产的中间体，在三个关键酶洛马津合酶、二氧四氢蝶啶合酶和核黄素合酶和双功能核黄素激酶/FMN腺苷酰转移酶的催化下生成FAD，这三个酶分别由ribH、ribE和ribF基因编码。黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径的强弱与甘油代谢速率及聚γ-谷氨酸的产量之间的关系并无报道。
技术实现思路
本专利技术的目在于提供一种通过在芽胞杆菌中强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成加速甘油代谢，从而提高聚γ-谷氨酸产量的方法，此方法通过在芽胞杆菌中的基因组内强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的关键基因ribE、ribF和ribH，FAD强化表达菌株甘油代谢速率比对照菌株提高，聚γ-谷氨酸产量比对照菌株提高，该研究结果表明强化表达FAD的合成是一种十分有效的提高微生物利用甘油的速率，提高聚γ-谷氨酸的方法，本研究为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。本专利技术第一方面提供了提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。优选的，所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF、ribH中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribH/ribE/ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ribF；S2、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达菌株构建：将表达载体pHY-ribH/ribE/ribF转入芽胞杆菌，以四环青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，PCR验证筛选得到过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌。优选的，所述芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02，该菌于2008年4月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M208065。更加优选的，步骤S1中，将P43-ribH/ribE/ribF–TamyL与质粒载体连接，转化DH5α，采用验证引物对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ribF。更加优选的，还包括步骤S3：将过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌进行种子培养、液体发酵；所述液体发酵培养基配方为：10-120g/L甘油；8-30g/L二水和柠檬酸三钠；0-25g/LNaNO3；6-20g/LNH4Cl；0.2-2g/LK2HPO4·3H2O；0.2-2g/LMgSO4·7H2O；0.2-2g/LZnSO4·7H20；0.2-2g/LCaCl2；0.1-1.0g/LMnSO4·H2O，pH5.5～8.0；所述液体发酵条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为8％-40％，摇床转速150-240r/min，发酵周期36-96h。进一步优选的，所述种子培养基为LB培养基，配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；所述种子培养条件为：培养温度为37℃，装液量为20％，摇床转速230r/min，培养时间为10h。本专利技术第二方面提供了一种聚γ-谷氨酸产量提高的重组芽胞杆菌，所述重组芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌中强化表达基因ribE或基因ribF或基因ribH而得到的。本专利技术的有益效果为：本方法采用分子生物学技术，通过在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的三个关键基因ribE、ribF和ribH，分别构建了三株FAD强化合成的菌株。在不同的液体发酵条件下，ribE、ribF和ribH过表达使甘油代谢能力比对照菌株分别至少提高了22.02％，20.62％和23.92％，这些重组菌株的聚γ-谷氨酸产量至少是对照菌株的1.20倍，1.18倍和1.27倍。由此表明，强化黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成可以显著提高芽胞杆菌甘油代谢，并增加聚γ-谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值。本专利技术提供的一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高地衣芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中步骤1和2得到的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为ribE、ribF、ribH基因片段，泳道5、6分为P43启动子、淀粉酶终止子片段；图2为实施例1中步骤3得到的目的表达元件的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，150本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ‑谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
【技术特征摘要】
1.一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF、ribH中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribH/ribE/ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ribF；S2、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达菌株构建：将表达载体pHY-ribH/ribE/ribF转入芽胞杆菌，以四环青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，PCR验证筛选得到过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌。3.根据权利要求1所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述芽胞杆菌为产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208065。4.根据权利要求2所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤S1中，将P43-...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，许勇，占杨杨，王欢，石姣，周梦林，马昕，李鑫，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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