一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法技术

本发明专利技术公开一种利用β‑1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法，该方法以酵母细胞为原料，通过对酵母细胞进行高温灭活处理，离心，干燥上清得到酵母提取物；利用β‑1,6葡聚糖酶酶解酵母细胞壁，离心，离心分别得到的酶解液上清和酶解沉淀，酶解液上清经水提醇沉、离心分离、干燥得到甘露糖蛋白；乙醇经回收后，剩余液体部分经浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；酶解沉淀经脱脂、蛋白酶处理、喷雾干燥得到酵母葡聚糖。本发明专利技术制备的酵母葡聚糖和甘露糖蛋白纯度高、得率高，且制备过程成本低，不使用强酸、强碱试剂，对环境污染小。

【技术实现步骤摘要】
一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法
本专利技术涉及一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法。
技术介绍
酵母是重要的食品和工业微生物，我国有丰富的酵母资源。酵母细胞壁由多糖、蛋白质以及少量的脂类、几丁质组成。两种主要的多糖分别是，β-D-葡聚糖，约占细胞壁干重的50-55％，分布于细胞壁的内侧，构成细胞壁的交联骨架结构；甘露聚糖蛋白分布于细胞壁的外侧，约占细胞壁干重的40-45％，赋予细胞生物学活性和控制细胞壁孔径。β-葡聚糖和甘露聚糖蛋白均具有丰富的生物学功能。酵母β-葡聚糖具有独特的三股螺旋结构，能与机体的免疫细胞受体特异性结合，刺激其处于高度活性状态。酵母β-葡聚糖通过与巨噬细胞受体结合，激活的巨噬细胞，起到抗肿瘤、抗菌、抗氧化和伤口愈合的作用。甘露糖蛋白由5-10％蛋白质和80-90％甘露聚糖组成，具有促进动物体液免疫和细胞免疫能力。甘露糖蛋白可以调节肠道菌群平衡，结合吸附外源性病原菌和毒素，并具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等活性功能。在食品加工方面，甘露糖蛋白能够有效地减少红酒在贮藏过程中酒石酸沉淀的产生，维持红酒的澄清，减弱葡萄酒中单宁的收敛性，促进红酒芳香物质的释放。此外，甘露糖蛋白还具有一定的乳化稳定作用和延长蔬菜瓜果货架期的能力。酵母β-葡聚糖和甘露糖蛋白可以从酵母中提取，目前实验室及工业制备工艺主要有酸碱提取法、热水浸提法、酶法以及以上方法的复合使用。FranziskusK等(1999)提出酸法提取甘露聚糖，将洗净湿酵母置于乙醇、硫酸和水(2:1:1，v/v/v)的混合物中，加热离心，取上清冷冻干燥得甘露聚糖，产物含蛋白质4.15％，总糖90.10％，其中甘露糖73.2％。CN101117358A披露了一种碱法制备甘露聚糖的方法，包括使用0.5-1.5mol/L的NaOH处理酵母细胞壁，经过12-20％的CTAB溶液和0.3-0.8％的硼酸钠-乙酸钠溶液去除蛋白，将上清液进行干燥得到甘露聚糖。酸碱提取法多使用高浓度的强酸、强碱，既会导致多糖活性降低，又会污染环境。刘红芝等(2009)确定了水提法制备酵母甘露聚糖的最佳条件，以废弃酿酒酵母为原料，在pH6.5、质量分数为3％的NaCl、温度为50℃、搅拌速率为120r/min的条件下振荡自溶24h；然后高温120℃处理3h；最后经过去蛋白、凝胶色谱柱分离得到纯度达到92.6％的甘露糖蛋白产品。热水浸提法成本低廉、操作简单，但是所得产品含有可溶性的氨基酸、色素等杂质，产品纯度低，需采用离子交换柱和电泳等方法进一步纯化。酶法制备β-酵母多糖的方法中，普遍采用的是利用自溶或者溶菌酶、昆布多糖酶等方法破坏细胞壁，接着应用淀粉酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶进一步纯化酵母多糖产物。Liu等(2011)提出了一种温和处理制备酵母β-葡聚糖的方法，主要步骤包括：诱导自溶、高温抽提、均质破壁、回流脱脂和生物酶解，最终β-D-葡聚糖得率达到11％，纯度高达93％。CN102603917披露了一种酶法制备酵母葡聚糖的方法，包括利用α-淀粉酶、糖化酶、甘露糖酶和中性蛋白酶，经过脱盐、脱脂和烘干得到高纯度的β-1,3-葡聚糖。CN104862355A披露了一种酶法利用酵母细胞壁联产葡聚糖、甘露糖蛋白的方法，包括加入碱性蛋白酶酶解高压均质处理的酵母细胞壁，离心重液干燥得到葡聚糖，离心轻液通过碱纳滤膜过滤，截留液浓缩干燥得到甘露糖蛋白。此外，CN1940084A是国内专利中唯一提出利用β-1,3-葡聚糖苷酶、β-1,6-葡聚糖苷酶、几丁质酶联合酶解，并且经过热解制备葡萄酒添加剂酿酒酵母甘露糖蛋白。酶法制备能够保持酵母多糖的天然结构和活性功能，但是酶法提取产物，蛋白含量高、纯度低，需采用离子交换柱和电泳等方法进一步纯化，而且酶价格昂贵，成本较高。基于目前酵母多糖活性组分提取的主要问题，本专利技术是在CN105524934A中涉及的粘细菌β-1,6-葡聚糖酶的基础上对于该酶在酵母细胞综合利用应用上的进一步保护。β-1,6-葡聚糖酶GluM是从Corallococcussp.EGB胞外上清液中纯化得到一个具有能专一性的切割以葡萄糖为组成单元、以β-1,6-糖苷键连接的葡聚糖。该β-1,6-葡聚糖酶GluM的比酶活力高达24000U·mg-1。而β-1,6-糖苷键是酵母细胞壁中的重要交联结构，将长链的β-1,3-葡聚糖和外层甘露聚糖交联成网状结构，β-1,6-糖苷键的破坏将导致整个细胞壁的裂解。此外，真菌来源的β-1,6-葡聚糖酶也可以起到类似的作用。而CN1940084A中利用了能够断裂酵母细胞壁整体结构连接的三个生物酶，其酶学活力和成本未可知。本专利技术只利用其中起到破坏交联结构的β-1,6-葡聚糖酶，并结合低廉、市场产品成熟的木瓜蛋白酶，即可高效、有针对性的促进甘露糖蛋白和酵母葡聚糖的释放，同时充分利用酵母细胞资源，得到酵母葡聚糖、酵母甘露糖蛋白和酵母提取物三个重要的活性组分。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供一种生物酶法，即利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法，以酵母细胞为原料，通过对酵母细胞进行高温灭活处理，离心、干燥上清得到酵母提取物；利用β-1,6葡聚糖酶酶解酵母细胞壁，离心分别得到的酶解液上清和酶解沉淀，酶解液上清经乙醇沉淀、离心分离、干燥得到甘露糖蛋白；乙醇经回收后，剩余液体部分经浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；酶解沉淀依次经脱脂、蛋白酶处理、喷雾干燥得到酵母葡聚糖。本专利技术技术方案所得的酵母提取物产品为淡黄色、粉末状固形物；甘露糖蛋白产品为白色、疏松状固形物；酵母葡聚糖产品为灰褐色、粉末状固形物。本专利技术所述的利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法，优选包括以下步骤：(1)以酵母细胞为原料，对酵母细胞进行高温灭活处理，离心分别收集沉淀和上清：沉淀为处理后的酵母细胞壁；上清浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；(2)向步骤(1)所得的酵母细胞壁中加入β-1,6-葡聚糖酶液，进行酶解反应，离心，收集上清；(3)将步骤(2)所得的酶解液上清，加入乙醇进行醇沉，离心，收集沉淀；(4)将步骤(3)所得沉淀，加入去离子水溶解，进行膜透析，收集截留液；(5)将步骤(4)所得截留液进行喷雾干燥，得到甘露糖蛋白；(6)将步骤(2)所得酶解液沉淀，加入石油醚，加热回流，离心，收集沉淀；(7)将步骤(6)所得沉淀，加入蛋白酶，进行酶解反应，离心，收集沉淀；(8)将步骤(7)所得沉淀进行喷雾干燥，得到酵母葡聚糖。(9)将步骤(3)所得的液体部分进行乙醇回收，回收后剩余液体经浓缩、喷雾干燥后得到酵母提取物。所述步骤(1)中，酵母细胞优选面包酵母细胞、酿酒酵母细胞、废弃工业酿酒酵母细胞中的任意一种或多种。所述步骤(1)中，废弃工业酿酒酵母细胞需进行前处理，包括：废弃工业酿酒酵母细胞配制成质量百分浓度为3-15％的悬浮液，经过孔径为80-120目的筛网，蒸馏水离心洗涤3-5遍，离心转速为10000-15000rpm，离心时间为10-15min。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用β‑1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法，其特征在于，以酵母细胞为原料，通过对酵母细胞进行高温灭活处理，离心，干燥上清得到酵母提取物；利用β‑1,6葡聚糖酶酶解沉淀中的酵母细胞壁，离心分别得到的酶解液上清和酶解沉淀，酶解液上清经乙醇沉淀、离心分离、干燥后得到甘露糖蛋白；乙醇经回收后，剩余液体部分经浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；酶解沉淀依次经脱脂、蛋白酶处理、喷雾干燥得到酵母葡聚糖。

【技术特征摘要】
1.一种利用β-1,6葡聚糖酶联产酵母葡聚糖、甘露糖蛋白和酵母提取物的方法，其特征在于，以酵母细胞为原料，通过对酵母细胞进行高温灭活处理，离心，干燥上清得到酵母提取物；利用β-1,6葡聚糖酶酶解沉淀中的酵母细胞壁，离心分别得到的酶解液上清和酶解沉淀，酶解液上清经乙醇沉淀、离心分离、干燥后得到甘露糖蛋白；乙醇经回收后，剩余液体部分经浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；酶解沉淀依次经脱脂、蛋白酶处理、喷雾干燥得到酵母葡聚糖。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以酵母细胞为原料，对酵母细胞进行高温破壁处理，离心分别收集沉淀和上清：沉淀为处理后的酵母细胞壁；上清浓缩、喷雾干燥得到酵母提取物；(2)向步骤(1)所得的酵母细胞壁中加入β-1,6-葡聚糖酶液，进行酶解反应，离心，分别收集酶解液上清和酶解沉淀；(3)将步骤(2)所得的酶解液上清，加入乙醇进行醇沉，离心，收集沉淀；(4)将步骤(3)所得沉淀，加入去离子水溶解，进行5-10kDa膜透析，收集截留液；(5)将步骤(4)所得截留液进行喷雾干燥，得到甘露糖蛋白；(6)将步骤(2)离心所得酶解沉淀，加入石油醚，加热回流，离心，收集沉淀；(7)将步骤(6)所得沉淀，加入蛋白酶，进行酶解反应，离心，收集沉淀；(8)将步骤(7)所得沉淀进行喷雾干燥，得到酵母葡聚糖。(9)将步骤(3)所得的液体部分进行乙醇回收，回收后剩余液体经浓缩、喷雾干燥后得到酵母提取物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酵母细胞选自酿酒酵母细胞、面包酵母细胞、废弃工业酿酒酵母细胞中的任意一种或多种。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，废弃工业酿酒酵母细胞需进行前处理，包括：将废弃工业酿酒酵母细胞配制成质量浓度为3-15％的悬浮液，经过孔径为80-120目的筛网，蒸馏水离心洗涤3-5遍，离心转速为10000-15000rpm，离心时间为10-15min。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔中利，乔燕，叶现丰，李周坤，曹慧，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32