一种金铁锁不定根悬浮培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，该方法包括如下步骤：(1)金铁锁无菌苗的诱导；(2)金铁锁的不定根诱导培养；(3)金铁锁的不定根悬浮培养。与现有技术相比较，本发明专利技术仅选用少量激素简单配比且取得较好效果，简化了培养基成分，以嫩茎直接诱导生成不定根；简化中间诱导愈伤组织的步骤，过程更简单，操作更简便，效率更高；通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的金铁锁不定根培养技术体系，为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供技术参数，也为将来通过组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷建立新的途径。适用于珍稀药物资源金铁锁的培养。

A Suspension Culture Method for Adventitious Roots of Golden-iron Lock

The invention discloses a method for suspension culture of adventitious roots of Golden-iron Lock, which comprises the following steps: (1) induction of sterile seedlings of Golden-iron Lock; (2) induction culture of adventitious roots of Golden-iron Lock; (3) suspension culture of adventitious roots of Golden-iron Lock. Compared with the existing technology, the present invention only chooses a small amount of hormones and achieves better results, simplifies the medium composition, directly induces adventitious roots from tender stems, simplifies the steps of intermediate callus induction, and has simpler process, simpler operation and higher efficiency. A simple, safe and efficient adventitious root culture technology of Golden Iron Lock has been established by tissue culture method. It provides technical parameters for the culture of adventitious roots from shaking flask to bioreactor, and also establishes a new way for the large-scale production of Au-Ti-Lock saponins by tissue culture technology in the future. It is suitable for the cultivation of golden iron lock, a rare drug resource.

【技术实现步骤摘要】
一种金铁锁不定根悬浮培养的方法
本专利技术涉及通过组织培养技术繁殖植物的方法，具体而言，涉及珍稀植物资源金铁锁不定根悬浮培养的方法。技术背景金铁锁(拉丁学名：Psammosilenetunicoides)别名：昆明沙参、独钉子、土人参、金丝矮坨坨、独定子、金丝矮陀陀、对叶七、白马分鬃、独鹿角姜、百步穿杨、穿石甲、蜈蚣七，石竹科金铁锁属稀有物种。为中国特有的单种属植物，分布于四川、贵州及云南、西藏等地。它是研究石竹科系统分类和进化极宝贵的材料、珍稀植物，又是常用中药材。当前，采用“毛状根”、“不定根”等生物技术定向培养植物细胞或器官来获取次生代谢产物，是珍稀濒危药用植物资源可持续开发利用研究的热点和有效途径。如王颖芳等发现发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇，可作为紫杉醇的主要来源；刘峻等研究人参毛状根时发现，人参总皂苷含量是原药材的1.7倍；步怀宇等研究发现，滇黄芩毛状根中黄芩苷是原药材的7.18倍。金铁锁“毛状根”培养也有少量报道。李景滨等利用发根农杆菌成功诱导金铁锁产生毛状根，并发现金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍，总皂苷是原植物的4倍。虽然通过毛状根培养技术能明显提高金铁锁总皂苷含量，但目前的研究还处于初级阶段，且存在转基因不明成分的风险。金铁锁不定根培养技术与毛状根不同，不定根不仅有生长速率快、遗传稳定、激素自养等特点，最重要的是它不需要发根农杆菌诱导，直接通过调节培养基激素种类或配比，通过组织培养就能诱导产生，不存在转基因问题。中国专利数据库中，已有一些涉及通过组织培养金铁锁的方法，例如：CN102057868号《一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法》、CN102771397号《一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法》、CN104845929号《金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法》、CN105432472号《一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法》等。这些技术方案还处于初级阶段，且存在转基因不明成分的风险。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，以解决金铁锁资源紧缺、市场供需矛盾突出的问题，同时为珍稀植物资源金铁锁的保护和可持续利用提供技术支撑。专利技术人提供的金铁锁不定根悬浮培养的方法，包括以下步骤：(1)金铁锁无菌苗的诱导选取饱满、健壮的金铁锁种子，经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡，然后用自来水冲洗干净，之后用升汞处理，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了赤霉素的1/2MS培养基培养，待子叶展开时，得到金铁锁无菌苗，备用；(2)金铁锁的不定根诱导培养在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，接种于含有不同激素的培养基中，进行不定根诱导培养；(3)金铁锁的不定根悬浮培养在无菌条件下，将上一步的金铁锁不定根按块状方式切取不定根丛，在装有液体培养基的瓶中进行悬浮培养，即得到大量不定根，用于皂苷提取与检测。上述第(1)步中，所述金铁锁种子的浸泡时间为30min；所述自来水洗净的金铁锁种子用升汞处理的时间为8～10min；所述无菌水冲洗的次数为3～5遍；所述添加赤霉素的1/2MS培养基培养条件是在25℃±1℃下，暗培养5～7天。上述第(2)步中，所述基本培养基是用1/2MS培养基附加30g/L蔗糖，12g/L琼脂，1g/L活性炭，1g/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮)组成的；所述不定根诱导培养是在24℃和12h/d光照周期下进行的；所述瓶中培养时，每瓶接种嫩茎为4个。上述第(3)步中，所述金铁锁不定根按每块约0.05g的块状切取；所述液体培养基的组成为：2/1MS+蔗糖30g·L-1+IBA(吲哚丁酸)1.0mg·L-1+NAA(α-萘乙酸)0.12mg·L-1；所述每瓶中液体培养基体积为40mL；所述培养时间为5～8周。本专利技术的创新点：当前金铁锁资源利用多以野生资源为主，人工栽培利用采用种子繁殖。本专利技术仅选用少量激素简单配比且取得较好效果，简化了培养基成分，以嫩茎直接诱导生成不定根，相比较现有技术，本专利技术简化中间诱导愈伤组织的步骤，过程更简单，操作更简便，效率更高；本专利技术通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的金铁锁不定根培养技术体系，为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供技术参数，也为将来通过组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷建立新的途径。附图说明图1为金铁锁不定根悬浮培养生长曲线。具体实施方式为筛选出激素配比、培养条件等关键技术参数，建立简便、安全、高效的金铁锁不定根悬浮培养技术方案，同时为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供基本参数，专利技术人进行了以下试验：实施例1基本参数的筛选试验1.1无菌苗诱导将饱满、健壮的金铁锁种子经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡30min左右，然后用自来水冲洗干净，在超净工作台上用升汞处理8～10min，无菌水冲洗3～5遍，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了不同浓度赤霉素的1/2MS培养基培养，以不添加任何激素的1/2MS培养基作为对照，在25℃±1℃下，暗培养5～7天，待子叶展开时备用，并计算种子萌发率，筛选出种子萌发的最佳培养基。1.2不定根诱导培养基筛选在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，选用1/2MS培养基附加30g/L蔗糖，12g/L琼脂，1g/L活性炭，1g/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮)为基本培养基，考察不同浓度水平的NAA(α-萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)对不定根诱导效果的影响。每瓶接种4个嫩茎，每个处理10瓶，在24℃和12h/d光照周期下进行不定根诱导培养，以不添加任何激素的1/2MS培养基作为对照。1.3不定根悬浮培养基筛选以金铁锁不定根最佳固体培养培养基配比、激素配比、培养条件为基本参数，选用1/2MS培养基为基本培养基，考察不同浓度蔗糖、NAA(α-萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)及其组合对不定根悬浮培养效果的影响。在无菌条件下，按块状方式切取金铁锁不定根丛进行培养，每块约0.05g，每瓶中液体培养基体积为40mL，每个处理10瓶，以不添加任何激素的1/2MS液体培养基作为对照，遮光摇床振荡培养，同时设立不遮光对照，30天后滤干培养液后用分析天平称量鲜重。试验因素水平见表1。表1不定根悬浮培养基筛选的试验因素水平1.4不定根生长曲线测定在上述筛选得到的最适培养基上按同样方法接种不定根，每隔1周测定一次平均瓶根重，共统计7周，测定不定根生长曲线。1.5不定根皂苷含量检测最新药理学研究表明，皂皮酸具有镇痛和抗炎作用，与金铁锁现代研究的药理活性相似。金铁锁苷类成分结构复杂，分离难度大，对照品尚未能商品化获得，因此，本实验皂苷含量测定以水解后的皂皮酸苷元作为金铁锁皂苷含量的评价指标。检测如下：Agilent1260型高效液相色谱仪。参考文献并经反复试验确定色谱分析条件为:色谱柱ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为乙腈-水；(B)系统，梯度洗脱(0～30min，50％A→95％A，30～45min，95％A→50％A)，流速1mL·min-1；进样量为10μL；紫外检测波长210nm。精密称取皂皮酸对照品适量，加甲醇稀释成1mL含皂皮酸1.049mg的对照品溶液，备用。精密吸取对照品溶液1，4，5，10，15，20μL进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，其特征包括以下步骤：(1) 金铁锁无菌苗的诱导选取饱满、健壮的金铁锁种子，经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡，然后用自来水冲洗干净，之后用升汞处理，无菌水冲洗；用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了赤霉素的1/2 MS培养基培养，待子叶展开时，得到金铁锁无菌苗，备用；(2) 金铁锁的不定根诱导培养在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，在装有基本培养基的瓶中接种嫩茎，进行不定根诱导培养；(3) 金铁锁的不定根悬浮培养在无菌条件下，将上一步的金铁锁不定根按块状方式切取不定根丛，在装有液体培养基的瓶中进行悬浮培养，即得到大量不定根，用于皂苷提取检测。

【技术特征摘要】
1.一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，其特征包括以下步骤：(1)金铁锁无菌苗的诱导选取饱满、健壮的金铁锁种子，经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡，然后用自来水冲洗干净，之后用升汞处理，无菌水冲洗；用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了赤霉素的1/2MS培养基培养，待子叶展开时，得到金铁锁无菌苗，备用；(2)金铁锁的不定根诱导培养在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，在装有基本培养基的瓶中接种嫩茎，进行不定根诱导培养；(3)金铁锁的不定根悬浮培养在无菌条件下，将上一步的金铁锁不定根按块状方式切取不定根丛，在装有液体培养基的瓶中进行悬浮培养，即得到大量不定根，用于皂苷提取检测。2.如权利要求1所述金铁锁不定根悬浮培养的方法，其特征在于第(1)步中，所述金铁锁种子的浸泡时间为30min；所述自来水...

【专利技术属性】
技术研发人员：席培宇，王虹，王济红，王莹，刘燕，
申请(专利权)人：贵州省生物研究所，
类型：发明
国别省市：贵州,52