检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用。本发明专利技术提供的分子标记能对油菜BnALS1R基因SNP突变位点的A或G碱基进行特异的区分和检测。发明专利技术提供的SNP分子标记的应用方法准确可靠，操作简便，适用于油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R基因型的鉴定及辅助选择育种。本发明专利技术提供的分子标记只需PCR和荧光检测两个步骤，成本低、通量高、加上特异性高，特别适用于育种群体中不同抗性基因型的分类筛选与鉴定。

SNP Marker Primers for Detecting BnALS1R Gene in Brassica napus and Their Application

The present invention discloses SNP marker primers for detecting BnALS1R gene of rape and its application. The molecular marker provided by the invention can specifically distinguish and detect the A or G bases of the SNP mutation site of the BnALS1R gene in rape. The application method of SNP molecular markers provided by the invention is accurate, reliable and easy to operate. It is suitable for identification of imidazolinone-resistant herbicide gene BnALS1R genotype and assistant selection breeding in rapeseed. The molecular marker provided by the invention only needs two steps of PCR and fluorescence detection, with low cost, high flux and high specificity, and is especially suitable for classification, screening and identification of different resistant genotypes in breeding populations.

【技术实现步骤摘要】
检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用
本专利技术涉及作物分子遗传育种
，具体涉及检测油菜BnALS1R基因的SNP标记引物及其应用。
技术介绍
油菜(BrassicanapusL.)是世界范围内广泛种植的重要油料作物，也是我国第一大油料作物。菜籽油不仅可以作为食用油，也是润滑油及生物柴油等工业原材料。我国国产菜籽油占国产油料作物产油量的55％以上，发展油菜生产对维护国家食用油供给安全具有重要的战略意义(王汉中，中国油料作物学报，2018，40(5)：613-617)。然而，随着我国油菜种植方式由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展，杂草危害已成为制约油菜全程机械化生产、轻简化栽培的重要环节之一。我国油菜田杂草种类多、数量大、危害重，长江流域冬油菜区杂草危害面积达46.9％，北方春油菜区草害面积高达90％以上，且以双子叶杂草为主。占全国油菜面积90％的冬油菜区，田间草相可分为两大类，稻茬油菜田为禾本科杂草和阔叶杂草混生型，旱茬油菜田以阔叶杂草为主(王汉中.中国油菜生产抗灾减灾技术手册.北京：中国农业科学技术出版社，2009：91-95)。生产上使用稳杀得、盖草能、禾草克等除草剂能有效防除油菜田单子叶杂草，对减轻杂草危害、降低人工除草劳动强度和提高油菜产量起到一定的作用。但对绝大多数阔叶杂草，目前生产上尚未开发出安全高效的除草剂。咪唑啉酮类除草剂是目前应用较广泛的一类除草剂，具有选择性强、广谱、高活性，可进行播前混土、苗前土表处理及茎叶喷雾，经植物根与叶吸收，既能防除一年生禾本科与阔叶杂草，也能防除多年生杂草。但该类除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也会产生药害，极大限制了其使用时间和空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽咪唑啉酮类除草剂的使用范围。研究表明，乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase，ALS)是咪唑啉酮类除草剂的靶酶，当ALS基因核酸序列变异造成编码蛋白氨基酸残基位点改变时，可以引起除草剂与ALS结合方式的变化产生抗性。2004初夏，江苏省农业科学院经济作物研究所浦惠明研究员在喷施咪唑啉酮类除草剂“豆施乐”的油菜和大豆轮作育种田中发现1株未被除草剂杀死的油菜植株，将其移入人工生长箱春化，并直至油菜开花结荚成熟。随后，通过连续多年自交及小孢子培养得到了抗性株系M9。多次抗性效应鉴定发现，M9抗除草剂的浓度是除草剂有效杀草浓度的2～3倍，抗性稳定、具有利用价值。笔者从M9中克隆到抗性基因BnALS1R发现，抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP，导致ASL1的第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。抗性基因BnALS1R的发现为我国提供了具有自主知识产权的抗除草剂基因，若能进一步找到与抗性基因紧密连锁的分子标记，则能进行标记辅助选择，指导田间育种，提高育种选择效率。专利CN102766697B中公开了一种三引物分子标记检测抗性基因BnALS1R基因型的方法。该方法引物设计较为复杂、操作繁琐，需要做2次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测，难以满足油菜田间育种选择的高通量需求。并且PCR产物检测过程中使用的EB易对环境造成污染、对人体产生危害。开发准确、灵活、操作简便检测抗性基因BnALS1R基因型的分子标记及建立高效、环境友好高通量的相关检测体系，则对促进BnALS1R基因在商业化育种中的应用具有重要意义。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了BnALS1R基因的SNP标记引物。本专利技术还要解决的技术问题是提供了SNP标记引物在检测油菜BnALS1R基因发生SNP突变方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种油菜BnALS1R基因发生SNP突变的检测试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种用于检测油菜BnALS1R基因第+1913位碱基发生等位基因分型的方法。本专利技术基于KASP(KompetitiveAllele-SpecificPCR，KASP)的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致性高；检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、EB对环境的污染和对人体的危害。本专利技术旨在开发抗性基因位点的KASP标记，快速、精确检测抗性基因BnALS1R，为利用抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种奠定基础。本专利技术还要解决的技术问题是提供了获得具有咪唑啉酮类除草剂抗性的分子标记辅助选择方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法。技术方案：根据前期我们的研究发现，油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是由单碱基突变引起的抗性差异。将已克隆的BnALS1R基因序列与野生型序列比对，确定该SNP在油菜BnALS1R基因的第+1913位。以候选SNP位点为中心提取两侧50bp侧翼序列设计多个引物组，经过多次多态性筛选获得，并在多个分离群体中经多次测试验证，标记KBnALS1R_19681913B扩增效果最佳。该标记含有三条引物，两条针对关键位点碱基差异设计的特异性引物，一条通用引物。本专利技术提供的SNP标记引物为以下特异性引物组合：(1)两条特异性引物：PrimerX：5′-TATTACATCTTTGAAAGTGCCACCAC-3′；PrimerY：5′-GTTATTACATCTTTGAAAGTGCCACCAT-3′；(2)一条通用引物：PrimerC：5′-CAGGACCATACCTGTTGGATGTGATA-3′。其中，所述两条特异性引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述通用引物如SEQIDNO.3所示。优选的，两条特异性引物5′端分别连接不同的荧光接头序列。更优选的，荧光接头序列为FAM或HEX。本
技术实现思路
还包括所述SNP标记引物在检测油菜BnALS1R基因发生SNP突变方面的应用。本
技术实现思路
还包括一种油菜BnALS1R基因发生SNP突变的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有所述的SNP标记引物。其中，所述检测试剂盒还包括KASP反应混合液。本
技术实现思路
还包括一种用于检测油菜BnALS1R基因第+1913位碱基发生等位基因分型的方法，所述检测方法包括以下步骤：1)提取油菜样品基因组DNA；2)以油菜基因组DNA为模板，利用所述的SNP标记引物进行KASP反应检测；3)如果只检测到第+1913位碱基对应的碱基G，则判定检测的油菜样品中不含抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的纯合体；如果只检测到第+1913位碱基对应的碱基A，则判定检测的油菜样品中含抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的纯合体；若检测位点第+1913位碱基同时检测到G和A，则判断检测的油菜样品中含抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的杂合体。其中，所述KASP反应检测包括PCR扩增和荧光检测，所述PCR扩增条件为：94℃15min；94℃20sec，61-55℃1min，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃20sec，55℃1min，共26个循环。本
技术实现思路
还包括获得具有咪唑啉酮类除草剂抗性的分子标记辅助选择方法，所述方法包括：采用所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.BnALS1R基因的SNP标记引物，其特征在于，所述SNP标记引物包括两条特异性引物和一条通用引物，所述两条特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述通用引物如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.BnALS1R基因的SNP标记引物，其特征在于，所述SNP标记引物包括两条特异性引物和一条通用引物，所述两条特异性引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述通用引物如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的SNP标记引物，其特征在于，所述两条特异性引物5'端分别连接不同的荧光接头序列。3.权利要求1或2所述SNP标记引物在检测油菜BnALS1R基因发生SNP突变方面的应用。4.一种油菜BnALS1R基因发生SNP突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有权利要求1或2所述的SNP标记引物。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括KASP反应混合液。6.一种用于检测油菜BnALS1R基因第+1913位碱基发生等位基因分型的方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：1）提取油菜样品基因组DNA；2）以油菜基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的SNP标记引物进行KASP反应检测；3）如果只检测到第+1913位碱基对应的碱基G，则判定检测的油菜样品中不含抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的纯合体；如果只检测到第+1913位碱基对应的碱基A，则判定检测的油菜样品中含抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的纯合体；若检测位点第+1913位碱基同时检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡茂龙，浦惠明，龙卫华，高建芹，郭月，程丽，彭琦，周晓婴，张维，张洁夫，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32