白木香AsWRKY44转录因子及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种白木香AsWRKY44转录因子及其应用，涉及基因工程领域，尤其涉及一种与沉香形成相关的白木香AsWRKY44转录因子及其应用。该转录因子通过与白木香倍半萜合酶ASS1的启动子上的W‑box结合，正常状态下抑制倍半萜合酶基因的转录表达，伤害及伤害信号诱导下，AsWRKY44降解，抑制作用解除，倍半萜合酶基因启动转录表达，合成沉香倍半萜，从而形成沉香，本发明专利技术不仅揭示了伤害诱导沉香形成的核心分子机制，还为白木香稳定高效结香技术的建立提供一种新的理论和方法。

Transcription Factor AsWRKY44 and Its Application

The invention discloses a transcription factor of AsWRKY44 and its application, which relates to the field of genetic engineering, in particular to a transcription factor of AsWRKY44 related to the formation of aloe and its application. The transcription factor can inhibit the transcriptional expression of sesquiterpene synthase gene in normal state by binding with W_box on the promoter of ASS1. Under the induction of injury and injury signal, AsWRKY44 is degraded, the inhibition is relieved, the sesquiterpene synthase gene activates transcriptional expression, and synthesizes sesquiterpene of agaric, thus forming agaric. The invention not only reveals the injury-induced agaric-shaped agaric. The core molecular mechanism also provides a new theory and method for the establishment of stable and efficient aroma-forming technology of Aristolochia sinensis.

【技术实现步骤摘要】
白木香AsWRKY44转录因子及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种白木香AsWRKY44转录因子及其应用。
技术介绍
沉香属白木香(Aquilariasinensis)，为我国特有的珍稀濒危植物，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一正品植物来源。沉香入药在我国传统中医学、藏医学和印度传统医学中已有几千年的历史。香港也因其历史上盛产和出口沉香而得名。然而，健康的白木香树体不能产生沉香，只有在受到伤害时才能结香(Ng,1997；Itoh,etal.,2002；PojanagaroonandKaewrak,2005；Persoon,2008)。研究表明，倍半萜类物质是沉香药材的最主要成分，也是其精油的主要成分(Hashimotoetal.,1985；Chenetal.,2011,Chenetal.,2012)。沉香倍半萜在健康白木香树中几乎没有，是树体受到伤害诱导后启动相应代谢途径合成的，因此，在正常健康的白木香树上无法获得沉香。倍半萜合酶ASS是倍半萜生物合成途径中催化FPP合成倍半萜的关键酶。前期我们从白木香克隆了一个关键倍半萜合酶基因ASS1，其纯化蛋白在体外能够以FPP为底物催化合成三种沉香倍半萜成分δ-愈创木烯(δ-guaiene)、α-愈创木烯(α-guaiene)和β-榄香烯(β-elemene)，该基因在健康的树体和愈伤组织中几乎不表达，但MeJA处理可显著提高其表达(Xuetal.,2013)。因此，倍半萜合酶基因ASS1是典型的诱导表达基因，而且在转录水平存在重要调控，然而，关于沉香倍半萜合酶基因的转录调控机制还未见报道。转录调控是通过启动子、结合在启动子上的转录因子及RNA聚合酶II的相互作用来完成的，控制着基因转录的起始、激活或抑制等行为。转录因子根据其调控功能分为转录激活子和转录抑制子。目前，在植物中关于转录激活子的正向调控研究较多，例如廖永翠公开的“茉莉酸信号途径参与调控沉香倍半萜生物合成的分子机制研究”博士论文中发现了可能与倍半萜和酶基因ASS1启动子的G-BOX结合的MYC2正调节子基因，以及与MYC2正调节子互作的JAZ基因，而对转录抑制的研究相对薄弱，但转录抑制在调节植物生存、生长方面具有十分重要的作用。因此，提供一种能够诱导沉香形成的核心分子机制的抑制子也极为重要。
技术实现思路
为多方面实现白木香树体植物次生代谢产物的调控及其抗性的调控，本专利技术提供一种白木香转录因子AsWRKY44基因及其编码蛋白，本专利技术提供的转录因子AsWRKY44通过与白木香倍半萜合酶ASS1的启动子上的W-box结合，作为一调控开关，在不同状态下控制倍半萜合酶基因的抑制转录表达或启动转录表达，实现沉香倍半萜合成的调控，本专利技术提供的转录因子不仅揭示了伤害诱导沉香形成的核心分子机制，还为白木香稳定高效结香技术的建立提供一种新的理论和方法。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术提供一种转录因子AsWRKY44，来源于瑞香科沉香树属白木香(Aquilariasinensis)，是：1)具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或替换和/或添加且具有相同功能的由SEQIDNO.1衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加。其中，SEQIDNO.1所示的氨基酸序列由542个氨基酸残基组成。编码上述蛋白质的cDNA分子也是本专利技术保护的范围。上述cDNA分子是如i)-iii)所示的任一一种cDNA分子；i)具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；ii)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交可以互作的核苷酸序列；iii)与i)或ii)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的核苷酸序列。其中，所述转录因子AsWRKY44可以根据上述氨基酸序列通过人工合成，或根据上述核苷酸序列先合成其编码基因，再进行生物表达得到。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术还提供编码转录因子AsWRKY44的表达盒。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术还提供编码转录因子AsWRKY44的重组表达载体。其中，所述重组表达载体是在pET-28a载体的多克隆位点间插入编码基因得到的重组表达载体。扩增上述任一所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。编辑上述任一所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术还提供编码转录因子AsWRKY44的转基因细胞系。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术还提供编码转录因子AsWRKY44的重组菌。上述蛋白、上述cDNA分析或上述表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在调控植物组织中基因转录活性中的应用也是本专利技术保护的范围。其中，所述植物为白木香。其中，所述调控为抑制。其中，所述调控是在健康状态下，抑制倍半萜合酶基因ASS1的表达。上述蛋白、上述cDNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中倍半萜合酶基因表达中的应用也是本专利技术的保护范围。上述蛋白、上述cDNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物次生代谢及抗性的应用也是本专利技术的保护范围。上述蛋白、上述cDNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控沉香合成的应用也是本专利技术的保护范围。其中，所述植物具体为白木香。其中，所述次生代谢为沉香倍半萜。其中，所述抗性是指对外界伤害的抵御能力。上述蛋白、上述cDNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备转基因植物中的应用也是本专利技术的保护范围。其中，所述转基因植物能够直接合成沉香的白木香。其中，所述转基因植物可以利用基因编辑技术进行制备。其中，所述转基因植物可以通过将转录因子AsWRKY44从白木香基因组中敲除进行制备得到。有益效果：本专利技术提供的AsWRKY44转录因子能够与ASS1启动子的关键调控区段W-box结合，使白木香在健康状态下抑制靶基因倍半萜合酶基因的正常转录，在伤害条件下或伤害信号诱导下使AsWRKY44蛋白逐渐降解，从而解除其对靶基因倍半萜合酶基因的抑制作用，靶基因倍半萜合酶基因ASS1得以表达，沉香倍半萜类物质开始合成，最终形成名贵中药材沉香，实现了白木香的次级代谢产物和抗性的调控，为白木香生产领域提供了一种切实可行的方法。附图说明图1为AsWRKY44基因在拟南芥原生质体中的细胞核定位；图2为pET-28a-AsWRKY44转化到大肠杆菌BL21(DE3)中全菌蛋白的表达结果；图3为纯化后的AsWRKY44蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；图4为AsWRKY44与ASS1互作的染色质免疫共沉淀结果；图5为AsWRKY44与ASS1互作的染色质免疫共沉淀结果统计柱形图；图6为MeJA处理下不同点AsWRKY44蛋白水平检测结果；图7为MeJA处理下不同点ASS1基因转录水平的real-timePCR检测结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，下述实施例中所用的结构如无特别说明，均为常规结构，本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，是转录因子AsWRKY44，其：i)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；ii)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或替换和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是转录因子AsWRKY44，其：i)具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；ii)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或替换和/或添加且具有相同功能的由SEQIDNO.1衍生的蛋白质；上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失或/或添加。2.编码权利要求1所述蛋白的cDNA分子。3.如权利要求2所述的cDNA分子，其特征在于，其具有如i)-ii)中任一一种的核苷酸序列：i)具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；ii)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的核苷酸序列；iii)与i)或ii)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述cDNA分子的重组表达载体、表达盒、重组菌；或，扩增或编辑权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。5.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏建和，徐艳红，孙佩文，余翠翠，唐小琳，吕菲菲，高志晖，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11