三维生物打印墨水的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用。在本发明专利技术中以明胶、海藻酸钠和I型胶原蛋白制备胶原水凝胶，加载小牛煅烧骨粉，制备得到的三维生物打印墨水，具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构。通过本发明专利技术，解决了相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题，采用本发明专利技术实施例的三维生物打印墨水制成的植骨材料，相对于多孔磷灰石陶瓷作为打印墨水制得的植骨材料而言提高了生物相容性，相对于小牛煅烧骨制得的植骨材料而言提高了植骨材料产品的可塑性和临床操作性。

Preparation and Application of Three-dimensional Bioprinting Ink

The invention provides a preparation method and application of three-dimensional biological printing ink and three-dimensional biological printing ink. In the present invention, collagen hydrogel is prepared by gelatin, sodium alginate and type I collagen, and then loaded with calf calcined bone powder to prepare three-dimensional bio-printing ink, which has good biocompatibility, certain mechanical strength and three-dimensional porous three-dimensional structure. The present invention solves the problem of poor biocompatibility or plasticity of bone graft material products in related technologies. The bone graft material made of the three-dimensional bioprint ink according to the embodiment of the present invention improves the biocompatibility compared with the bone graft material made of porous apatite ceramics as printing ink and the bone graft material made of calf calcined bone. Plasticity and clinical operability of bone graft materials.

【技术实现步骤摘要】
三维生物打印墨水的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物活性复合植骨材料领域，具体而言，涉及一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用。
技术介绍
在羟基磷灰石家族成员中，纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite，简称为HA)的晶体结构与骨组织中的矿物质微粒结构基本相同，磷酸钙(TricalciumPhosphate，简称为TCP)在骨组织中也占有一定比例，其降解速率远大于HA，在体内易于降解。降解速率除与化学组分有关外，还与其与体液间的接触面积相关。多孔磷灰石陶瓷的最佳设计原则在于兼顾降解速率及有利于新生骨组织的长入，即300um-500um的大孔、兼具微米级的小孔结构。尽管钙磷陶瓷的成型制作技术有了大的发展，如计算机控制的三维陶瓷打印技术。然而在读取天然骨组织的结构信息时，仍受到测量表征技术及加工技术的限制，缩短与天然骨组织的差距仍是一个长期的努力目标。小牛煅烧骨(DeproteinBovineBone，简称为DBB)是现有骨修复材料之一，既保留了无机钙磷矿物质，又基本保留了骨组织的多孔结构，在临床应用中得到了较好的评价。但小牛煅烧骨强度较差，由于经高温烧成，完全失去了胶原蛋白，纳米晶体发生了改变，不易降解；直接应用在三维打印中也不易塑型。随着骨组织三维生物打印技术的发展，使用细胞与生物活性基质材料共同打印水凝胶与明胶构成的生物墨水，可构建出预设的微结构，并具有较高的细胞存活率(＞90％)。为保证水凝胶能顺利挤出，基质材料需具备一定的流动性，细丝落入打印平台中因自身重力和上层结构堆积会发生形变，难以构建高精度复杂模型。虽然目前研究中可采用化学交联等方法促使水凝胶快速成型，但过量交联已证实会影响细胞的迁移、增殖以及分化。此外，受限于打印材料的黏度，钙磷(Ca-P)材料通常为纳米级，因此缺乏微米级小孔。为构建具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构，还要有合适的降解速率维持新生组织的生长，研究可快速成型、可混合细胞的小牛煅烧骨生物打印墨水就是目前生物三维打印中至关重要的内容。
技术实现思路
本专利技术提供了一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用，以至少解决相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题。第一方面，本专利技术实施例提供了一种三维生物打印墨水的制备方法，包括：步骤1，配制海藻酸钠水溶液；步骤2，向所述海藻酸钠水溶液中加入明胶，制成海藻酸钠-明胶均一的水凝胶；步骤3，选用牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；步骤4，选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料进行改性，煅烧后，获得煅烧骨粉；步骤5，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白和所述煅烧骨粉，搅拌均匀，制备得到三维生物打印墨水。可选地，所述步骤3包括：选取牛筋腱，清洗干净，使用粉碎机，将大块的牛筋腱切成小尺寸的牛筋腱；使用闪式提取技术处理牛筋腱，向提取物中加入乙酸，得到天然胶原粗料，再经过离心，透析步骤的纯化分离，获得I型胶原蛋白粗料；将所述I型胶原蛋白粗料通过胃蛋白酶处理，获得去端肽的无免疫原性的I型胶原蛋白，即为所述I型胶原蛋白。可选地，所述步骤4包括：选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水洗净，以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；以磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或磷酸为改性剂，对基本去除胶原蛋白的骨原料的骨盐进行改性，使其骨盐的钙磷原子比Ca/P降至1.5～1.67；经800℃-1100℃高温煅烧，去除免疫原性，即得所述煅烧骨粉。可选地，所述步骤5包括：将水凝胶/I型胶原蛋白的质量比0.2-0.5的比例，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白，混合均匀，获得胶原水凝胶；选用孔隙率达70％-80％、粒度为60-100目的煅烧骨粉，按照煅烧骨粉/胶原水凝胶相对质量比0.10-0.25的比例，将煅烧骨粉加入胶原水凝胶，混合均匀，并调整粘度范围为30-107mPa/s，pH至6.5-7.5，即得所述三维生物打印墨水。第二方面，本专利技术实施例提供了一种三维生物打印墨水，所述三维生物打印墨水是通过第一方面所述的方法制备的。第三方面，本专利技术实施例提供了一种第二方面所述的三维生物打印墨水在三维打印植骨材料中的应用，包括：在无菌环境中，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型，冷冻干燥，得到植骨材料产品。可选地，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型包括：将所述三维生物打印墨水经灭菌处理后，加载细胞和生物因子；使用加载了细胞和生物因子的三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型；其中，三维生物打印塑型时的环境温度为37℃左右。可选地，在所述三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl2溶液。通过本专利技术实施例提供的三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用，以明胶、海藻酸钠和I型胶原蛋白制备胶原水凝胶，加载小牛煅烧骨粉，制备得到的三维生物打印墨水，具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构。三维生物打印墨水中，胶原蛋白复合煅烧骨有利于成骨细胞的粘附增殖，胶原蛋白其在几个星期内成分将被缓慢吸收，无屏障作用。采用CaCl2溶液作为交联剂能够在3-5分钟时间里将墨水转变为均质固相，固化时间适宜，且产品具有一定的强度和弹性。通过本专利技术，解决了相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题，采用本专利技术实施例的三维生物打印墨水制成的植骨材料，相对于多孔磷灰石陶瓷作为打印墨水制得的植骨材料而言提高了生物相容性，相对于小牛煅烧骨制得的植骨材料而言提高了植骨材料产品的可塑性和临床操作性。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是根据本专利技术实施例的胶原蛋白红外特征谱图；图2是根据本专利技术实施例的胶原凝胶小牛煅烧骨三维生物打印植骨材料的结构示意图；图3是根据本专利技术实施例的证实支架羟基磷灰石包括HA和βTCP的X射线衍射图谱，其中DBB/Col为小牛煅烧骨和胶原蛋白组，DBB为小牛煅烧骨组；图4是根据本专利技术实施例的材料多孔特性的示意图；图5是根据本专利技术实施例的三维生物打印体结构中细胞紧密依附于磷灰石颗粒生长的示意图；图6是根据本专利技术实施例的三维生物打印支架网络中细胞均匀分布生长的示意图；图7是根据本专利技术实施例的三维生物打印支架网络中细胞成骨向分化的示意图。具体实施方式下面将详细描述本专利技术的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。对于本领域技术人员来说，本专利技术可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本专利技术的示例来提供对本专利技术更好的理解。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维生物打印墨水的制备方法，其特征在于，包括：步骤1，配制海藻酸钠水溶液；步骤2，向所述海藻酸钠水溶液中加入明胶，制成海藻酸钠‑明胶均一的水凝胶；步骤3，选用牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；步骤4，选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料进行改性，煅烧后，获得煅烧骨粉；步骤5，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白和所述煅烧骨粉，搅拌均匀，制备得到三维生物打印墨水。

【技术特征摘要】
1.一种三维生物打印墨水的制备方法，其特征在于，包括：步骤1，配制海藻酸钠水溶液；步骤2，向所述海藻酸钠水溶液中加入明胶，制成海藻酸钠-明胶均一的水凝胶；步骤3，选用牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；步骤4，选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料进行改性，煅烧后，获得煅烧骨粉；步骤5，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白和所述煅烧骨粉，搅拌均匀，制备得到三维生物打印墨水。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括：选取牛筋腱，清洗干净，使用粉碎机，将大块的牛筋腱切成小尺寸的牛筋腱；使用闪式提取技术处理牛筋腱，向提取物中加入乙酸，得到天然胶原粗料，再经过离心，透析步骤的纯化分离，获得I型胶原蛋白粗料；将所述I型胶原蛋白粗料通过胃蛋白酶处理，获得去端肽的无免疫原性的I型胶原蛋白，即为所述I型胶原蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4包括：选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水洗净，以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；以磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或磷酸为改性剂，对基本去除胶原蛋白的骨原料的骨盐进行改性，使其骨盐的钙磷原子比Ca/P降至1.5～1.67；经800℃-1100℃高温煅烧，去除免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕培军，李箐，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：北京,11