【技术实现步骤摘要】
一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：研究蛋白-蛋白相互作用在诸多生物学领域中有着极其重要的意义，对于解析细胞胞内的多种代谢过程，调控网络以及能量转化的分子机理至关重要。目前，验证蛋白-蛋白相互作用的方法主要包括几种经典的实验技术：酵母双杂交技术，大肠杆菌杂交技术，pull-down技术等等。酵母双杂交技术的特点在于灵敏、高效、高通量自动化。但在实际应用过程中存在诸多缺点，例如假阴性和假阳性太高；转化效率低；两蛋白在不同的载体上，其表达量受载体复制数的影响；同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质。pull-down技术需要纯化蛋白，不能坚持瞬时的蛋白相互作用并且具有假阳性。大肠杆菌杂交技术的宿主是原核生物，会造成很多假阳性和假阴性，并且该技术未实现高通量。综上所述，现有技术存在的问题是：现有的普遍技术中，由于技术问题或者物种同源性问题导致的假阳性和假阴性太高。现有的技术无法将原核生物中蛋白相互作用的关...
【技术保护点】
1.一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：基于pESD‑PPI质粒构建带有gfp和mCherry荧光基因的能进行Golden gat e组装表达质粒pESD‑PPI‑GFP‑mCherry；从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为分析运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；对分析结果进行量化，量化的公式：单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)*100％。
【技术特征摘要】
1.一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：基于pESD-PPI质粒构建带有gfp和mCherry荧光基因的能进行Goldengate组装表达质粒pESD-PPI-GFP-mCherry；从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为分析运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；对分析结果进行量化，量化的公式：单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)*100％。2.如权利要求1所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法包括：1)以F-1和R-1为引物，mCherry基因为模板扩增片段1；2)以片段1为模板，F-2和R-2为引物扩增片段2；3)以片段2为模板，F-3和R-2为引物扩增片段3；4)以pESD-PPI为模板，F-4和R-3为引物扩增片段4；5)以片段3和片段4为模板，F-3和R-3为引物扩增片段5；6)用NdeI和SalI酶切载体pESD-PPI，获得酶切载体1；7)利用Gibson装配试剂盒组装片段5和酶切载体1，转化大肠杆菌感受态，获得含mCherry的表达载体pESD-PPI-mCherry；8)以pEZ15a-lacUV5-GFP为模板，F-5和R-4为引物扩增片段6；9)以片段6为模板，F-5和R-5为引物扩增片段7；10)以pESD-PPI为模板，F-6和R-6为引物扩增片段8；11)以片段8和片段7为模板，F-6和R-5为引物扩增片段9；12)用PstI和BamHI酶切载体pESD-PPI-mCherry，获得酶切载体2；13)利用Gibson装配试剂盒组装片段9和酶切载体2，转化大肠杆菌感受态，获得含GFP和mCherry的表达载体pESD-PPI-GFP-mCherrySEQIDNO：5。3.如权利要求2所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法进一步包括：1)构建蛋白的表达载体：与NH2-TEVF融合表达蛋白的基因引物：F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物；R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物；与COOH-TEVF融合表达蛋白的基因引物：F：agcgt...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨世辉，杨青，唐莹，易犁，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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