一种基于抑制COX-2活性的中药组合物检测方法技术

本发明专利技术涉及一种中药组合物的检测方法，该方法以该中药组合物对COX‑2酶的抑制率作为测定指标，检测其抗炎活性。所述方法包括：A)制备中药组合物样品溶液和/或对照品溶液；B)测定样品溶液和对照品溶液对COX‑2酶活力的抑制率；C)以COX‑2酶活力抑制率为指标，计算效价和可信限率。

A Detection Method of Chinese Medicine Composition Based on Inhibiting COX-2 Activity

The present invention relates to a detection method of Chinese herbal medicine composition, in which the inhibition rate of the Chinese herbal medicine composition on COX 2 enzyme is used as an indicator to detect its anti-inflammatory activity. The methods include: A) preparation of sample solution and/or reference solution of traditional Chinese medicine compositions; B) determination of inhibition rate of sample solution and reference solution on COX_2 enzyme activity; C) calculation of potency and confidence limit rate with inhibition rate of COX_2 enzyme activity as index.

【技术实现步骤摘要】
一种基于抑制COX-2活性的中药组合物检测方法
本专利技术涉及中药组合物的生物检测方法，属于医药领域。
技术介绍
目前，中药复方的质量评价仅通过测定单一化学成分来进行，首先，该化学成分是否是复方发挥药效的物质，第二，控制该化学成分的最低含量是否能有效控制其质量的有效性和一致性？从目前的研究来看，仅通过测定单一化学成分对中药复方进行质量评价显然是不行的。因此，如何根据中药复方的具体情况，结合现代科学技术，探索能够符合中医药特点，在一定程度上既关联临床疗效又关联作用机制，具有可操作性的中药复方制剂质量评控方法，保证中药复方临床疗效的一致性和稳定性，是中药研究领域中最重要的课题之一。生物活性测定指导原则已被《中国药典》收录，并在水蛭等药材的质量控制中采用了生物评价的方法；美国FDA在《植物药研发行业指南》中也明确提出生物评价将作为植物药注册评审的主要内容。可见，生物评价已成为中药及中药复方制剂品质评价的发展方向。对于中药而言，临床应用绝大多数为中药复方，很少存在单一药味使用的情况，其复杂的成分以及多样的药理作用都决定了检测一种或几种活性成分并不能体现其整体药效，仅通过这一标准评价中药是行不通的。将生物评价方法引入中药质量控制体系不仅仅可以鉴定品种，评价质量，还可以与其药效相挂钩，并且观察其毒副作用。在某种程度上来说，利用生物评价方法检测中药的质量较传统化学方法存在着明显的优越性。其中对于中药大复方的分析更能体现其优势。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种中药组合物的生物检测方法，相对于现有技术仅检测一种或几种活性成分的检测方法，本专利技术的生物检测方法能更全面的表征中药组合物的整体药效，从而控制其质量。一种中药组合物的检测方法，该方法包括：将中药组合物制备为可检测的样品，与环氧化酶(COX)接触，测定样品对环氧化酶(COX)的抑制率。在具体的实施方式中，所述检测方法包括如下步骤：A)制备中药组合物样品溶液和/或对照品溶液；B)测定样品溶液和对照品溶液对COX-2酶活力的抑制率；C)以COX-2酶活力抑制率为指标，计算效价和可信限率；其中，步骤B测定样品溶液和对照品溶液对COX-2酶活力的抑制率可采用酶免疫法等进行测定。作为优选的实施方式，可按如下方法测定抑制率：a)向待测溶液中加入COX-2酶，培养一定时间；b)向待测溶液中加入ADHP和AA；c)显色，检测荧光强度；d)按如下公式计算抑制率，抑制率％＝(初始活性样品的荧光强度-待测样品的荧光强度)/初始活性样品的荧光强度×100％。优选的，步骤a中COX-2酶用量为500U/mL～1000U/mL；优选的，步骤b中AA经过纯化；优选的，步骤c中荧光强度在激发光波长530-540nm，发射波长585-595nm下检测。在具体的实施方式中，步骤A中所述对照品选自常规抗炎药物，如塞来昔布、罗非昔布(refocoxib)，或可用于作为对照品的本专利技术中药组合物。所述对照品溶液的制备方法包括：取对照品，加有机溶剂提取，提取液即为对照品溶液；优选的，所述对照品溶液浓度为1×105U/mL～2×105U/mL；更优选的，所述对照品溶液浓度为1.2×105U/mL。步骤A中所述中药组合物样品溶液的制备方法包括：取中药组合物，加有机溶剂提取，提取液即为对照品溶液；优选的，所述样品溶液浓度为1×105U/mL～2×105U/mL；更优选的，所述样品溶液浓度为1.2×105U/mL。其中，所述有机溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇等；所述提取方法选自超声提取、回流提取、微波提取中的任意一种。步骤C所述“效价”和“可信限率”按《药品生物检定》(周海钧主编)中“质反应平行线法”计算；抑制COX-2酶活力的效价不得低于500U·μg-1，平均可信限率小于25％。本专利技术所述中药组合物由如下原料药组成：连翘200-300重量份、金银花200-300重量份、炙麻黄50-100重量份、炒苦杏仁50-100重量份、石膏200-300重量份、板蓝根200-300重量份、绵马贯众200-300重量份、鱼腥草200-300重量份、广藿香50-100重量份、大黄30-80重量份、红景天50-100重量份、薄荷脑5-10重量份、甘草50-100重量份。优选的，所述中药组合物由如下原料药组成：连翘210-270重量份、金银花210-270重量份、炙麻黄60-90重量份、炒苦杏仁60-90重量份、石膏210-270重量份、板蓝根210-270重量份、绵马贯众210-270重量份、鱼腥草210-270重量份、广藿香60-90重量份、大黄40-60重量份、红景天60-90重量份、薄荷脑6-8重量份、甘草60-90重量份。更有选的，所述中药组合物由如下原料药组成：连翘255重量份、金银花255重量份、炙麻黄85重量份、炒苦杏仁85重量份、石膏255重量份、板蓝根255重量份、绵马贯众255重量份、鱼腥草255重量份、广藿香85重量份、大黄51重量份、红景天85重量份、薄荷脑7.5重量份、甘草85重量份。所述中药组合物的制备方法：以上十三味，广藿香加水蒸馏提取物挥发油，收集挥发油，水提取液滤过，备用；连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄用70％乙醇提取二次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液滤过，合并，回收乙醇，备用；金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天加水煎煮至沸，加入炒苦杏仁，煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，煎液滤过，滤液合并，加入广藿香提油后备用的水溶液，浓缩至相对浓度为1.10～1.15(60℃)，加乙醇使含醇量达70％，在4℃冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇，与上述连翘等四味的备用醇提取液合并，浓缩至相对密度为1.10～1.15(60℃)，喷雾干燥，与适量淀粉混匀，制成颗粒，干燥，过筛，筛出适量细粉，将薄荷脑、广藿香挥发油用适量乙醇溶解，喷入细粉中，混匀，与上述颗粒混匀，密闭30分钟，装入胶囊，制成1000粒，即得。本专利技术检测方法的原理是基于荧光法，在COX-2作用下，花生四烯酸(AA)转变为前列腺素环内过氧化物(PGG2)，催化产生的PGG2和ADHP(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)之间发生反应生成荧光物质试卤灵。在特定波长下产生荧光，通过检测试卤灵的荧光强度，即可体现COX-2酶活力的大小，进而评价待测药物抑制COX-2的活性(见图1)。本专利技术的有益效果：1、本专利技术基于网络药理学的预测、转录组学的验证和整体动物代谢组学的分析，确立了COX-2为抗炎生物活性指标建立中药组合物的质量生物活性评价方法；2、本专利技术以COX-2酶活力为指标，评价了中药组合物对COX-2酶活力的抑制作用，建立了一种结合临床适应症的酶水平的抗炎生物评价方法，经过方法学考察，该生物评价方法精密度较高，重复性较好，RSD值控制在10％以内，较细胞水平的抗炎生物效价方法更稳定；3、应用该方法对中药组合物进行生物活性评价，发现其批次间抑制COX-2的生物效价也存在一定的差异，从40个批次市售样品来看，其生物效价范围在510U/μg～1413U/μg之间，平均生物效价为856U/μg。实验室自制的破坏性样品抑制COX-2酶活力的生物效价较正常合格样品明显降低，提示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中药组合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将中药组合物制备为可检测的样品，与环氧化酶(COX)接触，测定样品对环氧化酶(COX)的抑制率；其中，所述中药组合物由如下原料药制成：连翘200‑300重量份、金银花200‑300重量份、炙麻黄50‑100重量份、炒苦杏仁50‑100重量份、石膏200‑300重量份、板蓝根200‑300重量份、绵马贯众200‑300重量份、鱼腥草200‑300重量份、广藿香50‑100重量份、大黄30‑80重量份、红景天50‑100重量份、薄荷脑5‑10重量份、甘草50‑100重量份。

【技术特征摘要】
1.一种中药组合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将中药组合物制备为可检测的样品，与环氧化酶(COX)接触，测定样品对环氧化酶(COX)的抑制率；其中，所述中药组合物由如下原料药制成：连翘200-300重量份、金银花200-300重量份、炙麻黄50-100重量份、炒苦杏仁50-100重量份、石膏200-300重量份、板蓝根200-300重量份、绵马贯众200-300重量份、鱼腥草200-300重量份、广藿香50-100重量份、大黄30-80重量份、红景天50-100重量份、薄荷脑5-10重量份、甘草50-100重量份。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：A)制备中药组合物样品溶液和/或对照品溶液；B)测定样品溶液和对照品溶液对COX-2酶活力的抑制率。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述COX-2酶活力的抑制率的测定方法包括如下步骤：a)向待测溶液中加入COX-2酶，培养一定时间；b)向待测溶液中加入ADHP和花生四烯酸；c)显色，检测荧光强度；d)按如下公式计算抑制率，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伽伯，肖小河，贾振华，张海珠，余方荣，葛新建，牛明，马永刚，王宏涛，田书彦，
申请(专利权)人：石家庄以岭药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13