一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法技术

本申请公开了一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法。所述方法包括如下步骤：S1、取海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示。本申请方法中使用的引物组合具有特异性好、灵敏度高、覆盖度高的优点，在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。

A Method for Detecting Norovirus Type G II in Marine Food

This application discloses a method for detecting Norovirus GII in marine food. The method comprises the following steps: S1, extracting viral RNA from marine food as a sample to be tested; S2, using the RNA or the DNA of the RNA as a template, using a specific combination of PCR primers to detect GII Norovirus for PCR detection; S3, detecting the products of the PCR to determine whether GII Norovirus is contaminated in the marine food to be tested; and GII Norovirus as a template. Specific PCR primer combinations include primer pairs that specifically amplify VP1 gene of GII Norovirus, the upstream primers of which are shown in SEQ ID No.1 and the downstream primers of which are shown in SEQ ID No.2. The combination of primers used in this method has the advantages of good specificity, high sensitivity and high coverage, and has broad application prospects in detecting Norovirus GII in marine food.

【技术实现步骤摘要】
一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法
本专利技术涉及生物
，具体说是一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus，NoV)又称诺瓦克病毒(NorwalkViruses)，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒，具有高度传染性和快速传播能力。诺如病毒为单股正链RNA病毒，直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称，属于杯状病毒科。诺如病毒基因组全长约7.7kb，分为三个开放阅读框(ORFs)，两端是5’和3’非翻译区(UTR)，其中，ORF1编码6个非结构蛋白，主要包括核苷酸水解酶、3C样蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶；ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(VP1)和次要结构蛋白(VP2)。VP1包含两个区域，分别为外壳区(S区)和突出区(P区)，两者通过灵活的铰链相连，S区由VP1的N端的225个氨基酸残基构成，形成光滑的病毒衣壳，围绕病毒RNA，P区由226位氨基酸到羧基末端构成，从衣壳向外二聚化在衣壳表面上形成拱状突起结构，分为亚区P1(拱干，由226-278位氨基酸残基以及406-520位氨基酸残基构成)和亚区P2(拱顶，由279-405位氨基酸残基构成)，P2是最可变区，包含碳水化合物结合序列和血型组织抗原(HBGAs)结合序列。VP2位于病毒粒子内部，被认为参与衣壳的聚集。诺如病毒按照VP1蛋白编码序列的不同，分GⅠ～GⅦ七种基因型，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ是目前已知可以感染人的基因型，而GⅢ、GⅤ分别感染牛和鼠。我国目前最常见的诺如病毒为GⅡ、GⅠ型。目前，GⅠ型含有至少9个基因亚型，GⅡ型含有至少21个基因亚型。GⅡ.4亚型及其突变株是目前全球广泛流行的优势毒株，但2014年冬季以来，GⅡ.17变异株所致的暴发疫情大幅增加。诺如病毒传染性强，感染剂量可以低至10—100个病毒粒子，且不同基因型之间的基因组重组频繁发生，使诺如病毒具有相当高的变异性，开发针对所有变异株或基因亚型的检测方法很难，常常导致假阴性的发生。诺如病毒的传播途径主要有人传人(接触)、食源性传播和水源性传播。诺如病毒主要来源于海洋产品，通常栖息于海洋生物如牡蛎等贝类中，人若生食这些受污染的海洋生物会被感染。因此，对海洋食品进行诺如病毒检测十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，该方法中使用的引物组合具有特异性好、灵敏度高、覆盖度高的优点，在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。一方面，本专利技术提供了一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，包括如下步骤：S1、取海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，所述引物对的下游引物如SEQIDNo.2所示。在一种优选的实施方式中，为了进行如荧光定量PCR或数字PCR等需要通过检测信号大小的方法检测靶基因数量时，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列。在上述方法中，优选的，所述探针为Taqman探针；更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、TexasRed或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。在一种优选的实施方式中，所述PCR为实时荧光PCR，所述实时荧光PCR的反应体系包含：qPCR缓冲液、dNTPs、MgSO4、二甲基亚砜、所述引物对的上游引物、所述引物对的下游引物、所述探针、DNA聚合酶、模板DNA和水；所述实时荧光PCR的反应体系中，所述MgSO4的终浓度为1mmol/L，二甲基亚砜的终浓度为8％、所述引物对的上游引物的终浓度为2μmol/L、所述引物对的下游引物的终浓度为2μmol/L、所述探针的终浓度为0.2μmol/L、DNA聚合酶的终浓度为0.5U/μL。在一种优选的实施方式中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预热5min；95℃变性25s，60℃退火延伸50s，42个循环。在一种优选的实施方式中，待测样品的Ct值大于或等于42时，判定为GⅡ型诺如病毒阴性；待测样品的Ct值小于或等于37时，判定为GⅡ型诺如病毒阳性；待测样品的Ct值大于37且小于42时，应重新检测。另一方面，本专利技术还提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，所述引物对的下游引物如SEQIDNo.2所示，优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列。另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测GⅡ型诺如病毒的PCR试剂盒，所述试剂盒包括：检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，所述引物对的下游引物如SEQIDNo.2所示；优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列；优选的，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTPs、Mg2+、二甲基亚砜、和DNA聚合酶。本专利技术保护所述引物组合或所述试剂盒在检测GⅡ型诺如病毒中的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术方法使用实时荧光PCR方法检测GⅡ型诺如病毒，具有特异性好，与GⅡ型诺如病毒之外的病毒无交叉反应，假阳性和假阴性低；灵敏度高，最低检测限可达0.005pg/μL；覆盖度高，可以检测目前所有已知亚型的GⅡ型诺如病毒毒株。本专利技术在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的商业化病毒RNA提取试剂盒为天根生化科技公司的TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒。下述实施例中实时荧光PCR使用Bio-rad公司PCR仪进行。实施例1、实时荧光PCR引物设计从NCBI检索获取所有GⅡ型诺如病毒VP1基因序列信息，经序列分析和比对，找到GⅡ型诺如病毒所具有的高度保守区域，设计8对引物及其探针，并进行BLAST序列比对，筛选出特异性较好的4对引物及其探针组合，然后进行序列的生物合成，其中，在每条探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1，各组合序列如表1所示。表1、引物及其探针组合的序列实施例2、实时荧光PCR检测GⅡ型诺如病毒的特异性使用实施例1中表1所示的4对引物及其探针组合，分别进行实时荧光PCR检测被如下不同病毒感染的牡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取待测海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取待测海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQIDNo.1所示，所述引物对的下游引物如SEQIDNo.2所示。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQIDNo.3或其互补序列。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述探针为Taqman探针；优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、TexasRed或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR为实时荧光PCR，所述实时荧光PCR的反应体系包含：qPCR缓冲液、dNTPs、MgSO4、二甲基亚砜、所述引物对的上游引物、所述引物对的下游引物、所述探针、DNA聚合酶、模板DNA和水；所述实时荧光PCR的反应体系中，所述MgSO4的终浓度为1mmol/L，二甲基亚砜的终浓度为8％、所述引物对的上游引物的终浓度为2μmol/L、所述引物对的下游引物的终浓度为2μmol/L、所述探针的终浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志敏，毕迎斌，徐娜，
申请(专利权)人：山东时进检测服务有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37