一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法技术

一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽‑1的方法。首先化学合成得到含有BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点及His‑tag标签的重组胰高血糖素样肽‑1目的基因片段，插入带有SamyQ信号肽序列的pHT43载体质粒中，经大肠杆菌DH5α扩增后，筛选阳性克隆，经过测序验证后，将测序正确的质粒大量抽提，经过电转化方法导入枯草芽孢杆菌WB800N宿主中，培养并且经过1mM IPTG诱导表达后，发酵液上清经过Tricine–SDS‑PAGE及Western Blot方法证明重组胰高血糖素样肽‑1（hmGLP‑1）的重组蛋白成功获得表达。本发明专利技术通过重组胰高血糖素样肽‑1基因导入肠道益生菌枯草芽孢杆菌中，使之成为能够表达其蛋白的重组菌，为后续制备活菌制剂和进行动物模型实验奠定基础。

A method for expression of recombinant glucagon-like peptide-1 by Bacillus subtilis

A method for expressing recombinant glucagon-like peptide 1 by Bacillus subtilis is described. Firstly, the recombinant glucagon-like peptide 1 gene fragment containing BamH I/Xba I cleavage site and His tag tag was synthesized by chemical synthesis. The gene fragment was inserted into the pHT43 vector vector with SamyQ signal peptide sequence. After amplification by E.coli DH5alpha, the positive clones were screened. After sequencing verification, the correct plasmids were extracted in large quantities, and then transformed into Bacillus subtilis W. In B800N host, the recombinant glucagon-like peptide 1 (hmGLP 1) was successfully expressed in the supernatant of fermentation broth by Tricine-SDS_PAGE and Western Blot methods after cultured and induced by 1mM IPTG. The recombinant glucagon-like peptide 1 gene is introduced into intestinal probiotic Bacillus subtilis to make it a recombinant bacteria capable of expressing its protein, which lays a foundation for subsequent preparation of live bacteria preparation and animal model experiment.

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法。
技术介绍
胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likepeptide-1,GLP-1）是由人体肠道L细胞合成分泌的一种30个氨基酸构成的短肽类激素，它是一种生理性肠降血糖素，可有效促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降血糖作用。还可抑制胰高血糖素分泌和胰岛细胞凋亡，促进胰岛β细胞增殖，抑制肠胃蠕动和延缓胃排空，减少饮食摄入，明显降低患者空腹和餐后血糖水平，在治疗T2DM方面具有良好的应用前景。但由于人体内存在二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ,DPPⅣ)，可将其分解为无活性的GLP-1(9-37)，导致GLP-1的生物半衰期仅有2分钟左右，大大限制了其临床应用。国内外学者已研发出各种延长半衰期的策略，包括氨基酸点突变、脂肪酸连接修饰、与人血清白蛋白融合或与单克隆抗体的可结晶区(Fc)融合表达、药物持续递送系统及聚乙二醇化修饰等。当前应用于市场上的GLP-1药物主要由两种：DPP-Ⅳ抑制剂（如西格列汀、维格列汀、沙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽‑1的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选取人胰高血糖素样肽‑1，将其氨基酸序列中2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到化学合成目的基因片段重组胰高血糖素样肽‑1，然后合成重组pHT43‑hmGLP‑1质粒；2）将重组质粒转入大肠杆菌DH5α超级感受态，抗性筛选重组质粒，并扩增提取；3）制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，电转化培养单克隆菌落；4）将单克隆菌落接种到培养基上面，置于摇床中过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增；5）重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达。

【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选取人胰高血糖素样肽-1，将其氨基酸序列中2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到化学合成目的基因片段重组胰高血糖素样肽-1，然后合成重组pHT43-hmGLP-1质粒；2）将重组质粒转入大肠杆菌DH5α超级感受态，抗性筛选重组质粒，并扩增提取；3）制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，电转化培养单克隆菌落；4）将单克隆菌落接种到培养基上面，置于摇床中过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增；5）重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达。2.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述目的基因片段的碱基序列如下：CATAGTGAAGGTACCTTTACCAGTGATGTTAGTAGTTATTTGGAAGGTCAGGCGGCGCAGGAATTTATTGCGTGGTTGGTTGATGGTCGC。3.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤1）中合成重组pHT43-hmGLP-1质粒是通过在目的基因片段的5'端添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁国跃，袁婧，屠志刚，郭畅，杨玲，赵志聪，李昊翔，徐梦娇，丁艺，
申请(专利权)人：江苏大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32