一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以及该节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还公开了上述节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜镰刀菌酸抗性方面的应用。

A WRKY transcription factor gene CqWRKY1 from Chieh-qua and its application

The present invention discloses a WRKY transcription factor gene CqWRKY1 of Chieh-qua, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1. As well as the coding protein of WRKY transcription factor gene CqWRKY1, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2. The invention also discloses the application of the WRKY transcription factor gene CqWRKY1 in regulating Fusaric acid resistance of the melon.

【技术实现步骤摘要】
一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用
本专利技术属于节瓜
，具体涉及一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用。
技术介绍
瓜类枯萎病(FusarumoxysporusSchl.f.sp.cucumerirumOwen.)又称蔓割病、萎凋病，是一种世界性土传病害，一般由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起，主要危害黄瓜、冬瓜、节瓜等其它葫芦科属作物。节瓜(BenincasahispidaCogn.var.Chieh-quaHow)是葫芦科冬瓜属的重要蔬菜作物，也是我国岭南地区的名优瓜类蔬菜，深受消费者喜爱。近年来，节瓜枯萎病发病趋势日益加剧，严重阻碍了节瓜的生产。由于节瓜遗传背景狭窄，抗枯萎病资源较少，尚未分离出优异的枯萎病抗性基因，且抗性分子机理研究缺乏。WRKY类转录因子是广泛存在于植物界中的一类重要转录调控因子，其N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列，通过调节启动子中含W-box元件的基因的表达，参与植物对病原体的防卫反应、非生物胁迫、生长发育等过程，特别是在植物抗病反应中起到重要的作用。然而，目前关于WRKY类转录因子在节瓜枯萎病抗性方面的研究尚未见报道。因此，开展节瓜WRKY类转录因子在节瓜枯萎病抗性方面的研究，不仅可以在遗传水平方面揭示WRKY参与节瓜枯萎病抗性的作用，也为节瓜枯萎病抗性分子辅助育种提供理论支撑，具有重要研究价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其编码蛋白。本专利技术的目的还在于提供上述节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1的应用。本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1是将节瓜幼苗真叶的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。其中引物对具体为：CqWRKY1-F：ATGGCCTCCTCTTCCGGGAGCqWRKY1-R：CTAACATAGGAGAGATTGGA本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜镰刀菌酸抗性方面的应用。本专利技术将CqWRKY1基因克隆到pEarleyGate101载体上，获得pEarleyGate101-CqWRKY1植物过表达载体。结果发现，在镰刀菌酸(Fusaricacid，FA，枯萎病病菌分泌物，市售)胁迫下，转基因植株的抗性明显弱于对照，说明节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜枯萎病抗性方面有一定的负向作用。因此，在后续的生产实践中，可以通过敲除节瓜中的WRKY类转录因子基因CqWRKY1，从而提高节瓜的抗枯萎病性能。本专利技术具有如下优点：本专利技术利用电子克隆技术分离鉴定了节瓜CqWRKY1的编码序列信息；利用特异引物研究了CqWRKY1在不同逆境胁迫下的表达，发现节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1可以被多种胁迫因素诱导表达；构建的节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1过表达植株的镰刀菌酸抗性降低，说明该基因负调控节瓜的枯萎病抗性，因而可以进一步在后续的生产实践中，可以通过敲除节瓜中的WRKY类转录因子基因CqWRKY1，从而提高节瓜的抗枯萎病性能。附图说明图1是实施例1中节瓜CqWRKY1基因的克隆，其中1-3是CqWRKY1基因的CDS扩增结果，M是DNAMarker条带；图2是实施例2中节瓜CqWRKY1基因在不同逆境胁迫下的表达；图3是实施例3中节瓜CqWRKY1过表达阳性植株的检测；图4是实施例4中CqWRKY1过表达植株的镰刀菌酸抗性降低，其中A图代表镰刀菌酸处理前植株的生长状况，B图为镰刀菌酸处理后植株的生长情况，OE5、6、13分别代表过表达(Overexpressing:OE)CqWRKY1基因的阳性纯合株系。具体实施方式下面结合实例具体进一步说明本专利技术的具体实施方式。实施例1节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其编码蛋白的获取(1)RNA提取和cDNA的克隆选用的节瓜品种为新农民节瓜品种的自然授粉后代经过系谱法选育而来的纯合自交系材料。温汤浸种种子6-8小时，然后在30-32℃的培养箱中催芽2-3天，待种子露白时播种。幼苗长到一叶一心后，对3株幼苗的真叶进行混合取样，加入液氮后用研钵裂解组织和细胞，并迅速转入2.0mL的离心管中，采用植物总RNA提取试剂盒(RNApreppureTissueKit，TIANGEN)；用分光光度计检测RNA的浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。接下来，使用大连宝生物公司的逆转录试剂盒(PrimeScriptReverseTranscriptasekit，Takara)，反转录成cDNA。(2)CqWRKY1基因的扩增以节瓜总cDNA为模板，以CqWRKY1-F(atggcctcctcttccgggag，如SEQIDNO：3所示)和CqWRKY1-R(ctaacataggagagattgga，如SEQIDNO：4所示)为正向和反向引物，克隆获得节瓜CqWRKY1基因片段。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性2分钟，72℃延伸45秒，34个循环后72℃8分钟。最终PCR产物进行测序，获得了CqWRKY1的序列，如图1所示，其中1-3是CqWRKY1基因的CDS扩增结果，M是DNAMarker条带。通过NCBI-Blast和MEGA6.0软件比对发现，该序列与西瓜WRKY1-like(HM030879.1)、黄瓜WRKY33-like(NM_001280728.1)等同源性较高，且含有PolyA结构，表明CqWRKY1是一个编码WRKY类转录因子的基因。该节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1的核苷酸序列具体如下：atggcctcctcttccgggagcgtagacacctctgctaattctcatccttctttcactttctctactcatccttttatgacttcttactctgaccttctcgcttcctccaacaacgatcctccttcctccgccgcaccccacgcttctctccgcggttccggtactggggttcctaaattcaaatccctccctcctccttctctccctctctctcctcctcccatgtctccttcttcctttttcgctattcctcctggcttgagtcccgctgagcttcttgattcccctgttcttctcagtgcttctcatgttctgccgtcgccgactaccgggagtttcccgtctcagtcgttgaattggaagagcaattctgggtgtaatcagcagagcattaaggaagaaaacaaatatttgtccaatttctcatttcaaactcaatcgtcaaagtttccgccgacgtcttttcagccttcatccacc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1，其特征是：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1的编码蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1所述的节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何晓明，王敏，彭庆务，刘文睿，林毓娥，江彪，杜翔斐，张金平，毛一舟，梁肇均，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44