黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及黄原胶裂解酶变体以及用于获得黄原胶裂解酶变体的方法。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Xanthan gum lyase variants and their polynucleotides

The invention relates to xanthan gum lyase variants and a method for obtaining xanthan gum lyase variants. The invention also relates to polynucleotides encoding these variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells containing these polynucleotides; and methods for using these variants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸对序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及相对于亲本黄原胶裂解酶在一种或多种特性中表现出改变的新颖黄原胶裂解酶变体，这些特性包括：洗涤剂稳定性(例如，在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的稳定性)和/或储存稳定性(例如，在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的储存稳定性)。本专利技术进一步涉及对黄原胶具有活性的新颖黄原胶裂解酶变体。本专利技术还涉及包含编码本专利技术的变体的多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及用于产生和使用本专利技术的变体的方法。本专利技术的变体适于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用，例如洗衣组合物和餐具洗涤组合物，包括手洗和自动餐具洗涤组合物。本专利技术进一步涉及包含本专利技术的变体和/或内切葡聚糖酶的组合物，用于在洗涤剂中和钻探和石油工业中使用。
技术介绍
黄原胶是一种衍生自野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)的细菌包衣的多糖。黄原胶通过由野油菜黄单胞菌细菌发酵葡萄糖、蔗糖、或乳糖而产生。在发酵周期后，用异丙醇将该多糖从生长培养基中沉淀、干燥、并磨成细粉。随后，将其添加至液体介质中以形成胶。黄原胶是由不同糖组成的天然多糖，这些不同糖通过若干不同键连接，例如β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键和β-D-葡糖基-β-D-1,4-葡糖基键。黄原胶在水中至少部分地可溶并且形成高黏性的溶液或凝胶。黄原胶的完全酶降解需要若干酶活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶并且已经被描述于文献中。黄原胶降解酶在本领域中是已知的，例如两种已经分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌(Paenibacillusalginolyticus)XL-1的黄原胶裂解酶(例如，Ruijssenaars等人(1999)‘Apyruvatedmannose-specificxanthanlyaseinvolvedinxanthandegradationbyPaenibacillusalginolyticusXL-1[在由溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶中涉及的一种丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65(6):2446-2452，和Ruijssenaars等人(2000)，‘AnovelgeneencodingxanthanlyaseofPaenibacillusalginolyticusstrainXL-1[一种编码溶藻弧菌类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶降解酶的新颖基因]’,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]66(9):3945-3950)。糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放更小的糖的酶。存在超过100种已经被分类的糖苷水解酶，参见Henrissat等人(1991)‘Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类]’，J.Biochem.[生物化学杂志]280:309-316和Uniprot网站，www.cazy.org。糖苷水解酶家族9(GH9)由超过70种不同的酶组成，这些酶大部分是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)和外切-β-葡糖胺酶(EC3.2.1.165)。近年来，黄原胶已经被用作许多消费产品中的成分，包括食品(例如，在色拉调料和乳制品中作为增稠剂)和化妆品(例如，在牙膏和化妆品、乳膏和洗剂中作为稳定剂和增稠剂以阻止成分分离，并且提供产品的合适质地)。此外，已经发现了黄原胶在石油工业中作为添加剂以调节钻井液的黏度的用途等。黄原胶的广泛使用已经导致希望降解含有黄原胶的溶液、凝胶或混合物从而允许更简单地去除副产品。用于降解黄原胶的黄原胶裂解酶和内切葡聚糖酶以及此类酶用于清洁目的(例如去除含有黄原胶的污渍)以及在钻探和石油工业中的用途是已知的，例如，WO2013167581A1。发现已知的具有SEQIDNO:2的黄原胶裂解酶对具有螯合剂的洗涤剂的存在敏感。为了改善此类酶的可应用性和/或成本和/或性能，持续搜寻具有改变的特性的变体，例如增加的稳定性，例如在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的稳定性等。然而，大酶诱变随后进行突变体文库的纯化和功能分析可能是非常昂贵并且费力的。
技术实现思路
由于已知的具有SEQIDNO:2的黄原胶裂解酶是大酶(>1000个残基)，因此随机地靶向其特性来改善例如洗涤剂组合物中(例如在螯合剂的存在下)的稳定性是困难且昂贵的。在一些方面，本专利技术鉴定了已知的具有SEQIDNO:2的黄原胶裂解酶的蛋白序列/结构中的螯合剂诱导的不稳定区(当在具有EDTA的缓冲液中孵育分子时，这些区受到影响)，并且因此提供了在何处使黄原胶裂解酶突变以在洗涤剂(例如包含螯合剂的洗涤剂组合物)中使分子稳定的重要指导。在一些方面，本专利技术涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQIDNO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQIDNO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQIDNO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQIDNO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQIDNO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQIDNO:2的氨基酸903至1004的区6。在一些方面，本专利技术涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQIDNO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQIDNO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQIDNO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQIDNO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQIDNO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQIDNO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQIDNO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性。在一些方面，本专利技术定义了具有以下特征中的一个或多个的亲本黄原胶裂解酶(例如，SEQIDNO:2)的螯合剂诱导的不稳定区：在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更可及(accessible)所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入。在一些方面，本专利技术涉及与SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，和vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.24 IN 2016410287791.一种黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：i)对应于SEQIDNO:2的氨基酸154至176的区1，ii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸614至658的区2，iii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸731至803的区3，iv)对应于SEQIDNO:2的氨基酸807至846的区4，v)对应于SEQIDNO:2的氨基酸872至885的区5，和vi)对应于SEQIDNO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQIDNO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。2.如权利要求1所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体与SEQIDNO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。3.如权利要求1或2所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：在位置155、159、620、624、626、631、635、649、650、656、738、745、752、753、754、757、769、775、777、779、782、786、789、792、796、799、801、819、824、843、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、933、941、966、991和998处的改变，其中根据SEQIDNO:2进行编号。4.如权利要求1-3中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626Q、T631N、S635E、S635T、T649V、T649K、Q650G、I656V、G738L、K745R、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、A769D、A769T、A769R、L775A、L775F、L775I、L775M、L775Q、L775S、L775Y、D777R、P779V、Y782I、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、D801G、K819R、K824R、A843P、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911M、A911V、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915S、T915V、T915Q、T919D、T919F、T919G、T921R、T921S、T923D、T923H、T925D、T925Q、T925R、T927K、D928W、Y930F、Y930H、Y930L、D933M、G941D、G941E、A966P、N991D和V998K，其中根据SEQIDNO:2进行编号。5.如权利要求1-4中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处进一步包含改变，该组由以下组成：vii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸1至153的区7，viii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸177至613的区8，ix)对应于SEQIDNO:2的氨基酸659至730的区9，x)对应于SEQIDNO:2的氨基酸804至806的区10，xi)对应于SEQIDNO:2的氨基酸847至871的区11，xii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸886至902的区12，和xiii)对应于SEQIDNO:2的氨基酸1005至1037的区13。6.如权利要求5所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变是在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016，其中根据SEQIDNO:2进行编号。7.如权利要求6所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R...

【专利技术属性】
技术研发人员：JE尼尔森，A斯文德森，L安德森，RN蒙拉德，RK塞纳思安，PF詹森，KD兰德，GH门德兹，S达拉尔，S阿加瓦尔，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK