核酸检测方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本发明专利技术涉及新的基于CRISPR系统的核酸检测方法。更具体而言，本发明专利技术涉及Cas12b介导的DNA检测方法及相关试剂盒。

Nucleic acid detection method

The invention relates to the field of genetic engineering. Specifically, the present invention relates to a new nucleic acid detection method based on RISPR system. More specifically, the present invention relates to Cas12b-mediated DNA detection method and related kits.

【技术实现步骤摘要】
核酸检测方法
本专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及新的基于CRISPR系统的核酸检测方法。更具体而言，本专利技术涉及Cas12b介导的DNA检测方法及相关试剂盒。
技术介绍
快速便携的核酸检测有望在临床诊断和检疫检测中发挥重要作用。CRISPR核酸酶Cas12a和Cas13，由于具有ssDNA或ssRNA反式切割活性已经被开发用于以高灵敏度和特异性快速检测DNA和RNA。基于CRISPR-Cas13的RNA检测平台称为SHERLOCK，基于Cas12a的DNA检测平台也称作DETECTR。开发进一步的具有更高灵敏度和更高特异性的核酸检测平台在本领域具有重要意义。专利技术简述本专利技术提供一种基于Cas12b的核酸检测方法，称为CDetection，能够以比Cas12a更高的特异性检测DNA，并且具有高达亚渺摩尔(attomolar)级的灵敏度。本专利技术还提供了增强的CDetection(eCDetection)，其能够实现区分仅有单个核苷酸多态性不同的两种靶DNA。基于CRISPR-Cas12b的CDetection技术能够提供快速简便的DNA检测方法，适用于健康领域和生物技术的各种应用。附图描述图1.Cas12蛋白中保守的靶识别激活非特异性单链DNA(ssDNA)切割。(a)示意图说明Cas12b具有经典的dsDNA靶识别和切割，以及非经典的旁路ssDNA切割。(b)M13mp18ssDNA底物切割时间曲线，其中纯化的AaCas12b、ArCas12a、HkCas12a、PrCas12a和SpCas9和与M13噬菌体互补的向导RNA(靶gRNA，OT(ontarget)-gRNA)结合。(c)M13mp18ssDNA底物切割时间过程，其中纯化的AaCas12b、ArCas12a、HkCas12a、PrCas12a和SpCas9和与M13噬菌体没有序列同源性的gRNA(非靶gRNA，NT(non-target)-gRNA)及互补ssDNA激活物结合。图2.Cas12b的RuvC结构域负责ssDNA反式切割。(a-b)M13mp18ssDNA底物和pUC19dsDNA切割时间曲线，其中纯化的WTAaCas12b和RuvC催化突变体(R785A或D977A)与靶gRNA(OT-gRNA)或非靶gRNA(NT-gRNA)结合(a)，或与NT-gRNA及互补ssDNA激活物(b)结合，其中非靶gRNA与M13噬菌体或pUC19没有序列同源性。图3.Cas12b介导的反式激活切割对非特异性ssDNA的偏好性。(a)AaCas12b介导的对含有A、T、G或C核苷酸同聚体的ssDNA报告分子的反式切割的核苷酸偏好性。将AaCas12b与靶向合成ssDNA靶1或靶2的sgRNA一起孵育。误差棒表示平均值的标准误差(s.e.m.)，n＝3。RFU，相对荧光单位。(b)测试多种缓冲液对Cas12b介导的反式激活切割的影响。将AaCas12b与靶向合成ssDNA靶1的sgRNA一起孵育。误差棒表示平均值的标准误差(s.e.m.)，n＝3。(c)使用on-target-ssDNA(靶-ssDNA或OT-ssDNA)、non-target-ssDNA(非靶-ssDNA或NT-ssDNA)、on-target-dsDNA(靶-dsDNA或OT-dsDNA)和non-target-dsDNA(非靶-dsDNA或NT-dsDNA)作为激活物，对AaCas12b的反式切割活性分析。误差条表示s.e.m.，n＝3。图4.Cas12b介导的DNA检测的特异性和灵敏度。(a)使用具有指示的单个错配的ssDNA或dsDNA激活物分析AaCas12b的反式切割活性。误差条表示s.e.m.，n＝3。RFU，相对荧光单位。PT，完美配对的靶。mPAM，突变的PAM。(b)使用具有指示的连续错配的ssDNA或dsDNA激活物分析AaCas12b的反式切割活性。误差棒表示s.e.m.，n＝3。(c)比较AaCas12b、PrCas12a、LbCas12a在区分dsDNA方面的特异性，使用合成的HPV16激活物。误差条表示s.e.m.，n＝3。(d)使用dsDNA激活物比较AaC2c1的反式切割活性和预扩增增强的反式切割活性(CDetection)。将AaCas12b与靶向靶1合成dsDNA的sgRNA一起温育。误差条表示s.e.m.，n＝3。RPA，重组酶聚合酶扩增。(e)基于AaCas12b、PrCas12a、LbCas12a的使用RPA预扩增的DNA检测所获得的最大荧光信号。将Cas12蛋白与靶向合成HPV16dsDNA的gRNA孵育，所述合成HPV16dsDNA与背景基因组混合。误差条表示s.e.m.，n＝3。(f)基于AaCas12b、LbCas12a的使用RPA预扩增的DNA检测所获得的荧光时间曲线。将Cas12蛋白与靶向合成HPV16dsDNA的gRNA孵育，所述合成HPV16dsDNA稀释于人血浆中，终浓度10-18M。误差条表示s.e.m.，n＝3。图5.AaCas12b介导的DNA检测的特异性和灵敏度。(a)比较没有预扩增的使用ssDNA或dsDNA激活物的AaCas12b反式切割活性。AaCas12b与靶向合成ssDNA或dsDNA的sgRNA一起孵育。误差条表示s.e.m.，n＝3。(b)AaCas12b检测到CaMVDNA的存在。(c)AaCas12b区分两种密切相关的合成HPV序列，其具有六个核苷酸多态性。误差棒表示s.e.m.，n＝3。(d)比较AaCas12b、PrCas12a、LbCas12a在区分dsDNA方面的特异性，使用合成的HPV18激活物。误差条表示s.e.m.，n＝3。(e)使用dsDNA激活物比较AaCas12b的反式切割活性和预扩增增强的反式切割活性(CDetection)。将AaCas12b与靶向靶2的合成ssDNA或dsDNA的sgRNA一起温育。误差条表示s.e.m.，n＝3。图6.CDetection在DNA检测中达到亚渺摩尔级灵敏度。(a)在检测和背景基因组混合的HPV16或HPV18dsDNA时，CDetection实现亚渺摩尔级灵敏度。误差棒表示平均值的标准误差(s.e.m.)，n＝3。RFU，相对荧光单位。(b)使用RPA预扩增，从基于AaCas12b和LbCas12a的DNA检测中获得的荧光时间曲线。Cas12蛋白与靶向合成HPV18dsDNA的gRNA混合，所述合成HPV18dsDNA稀释于人血浆中，终浓度10-18M。误差条表示s.e.m.，n＝3。图7.CDetection的应用。(a)通过CDetection检测ABO血液基因分型的示意图。示出六种常见ABO等位基因和三种靶向性sgRNA。各sgRNA以可检测信号区分出各自对应的等位基因。如果所有sgRNA均没有产生信号，则等位基因为A101或A201。(b)使用CDetection进行ABO血液基因分型获得的荧光信号。CDetection未能区分仅有一个单碱基多态性不同的两种dsDNA激活物(on-B101vs.off-B101，on-O01vs.off-O01，on-O02/03vs.off-O02/03)。误差棒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测生物样品中靶核酸分子的存在和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述生物样品接触：i)Cas12b蛋白，ii)针对所述靶核酸分子中的靶序列的gRNA，和iii)被切割后产生可检测信号的单链DNA报告分子，从而形成反应混合物；(b)检测所述反应混合物中产生的可检测信号的存在和/或水平，其中所述可检测信号的存在和/或水平代表所述靶核酸分子的存在和/或量。

【技术特征摘要】
2018.09.20 CN 20181109914601.一种检测生物样品中靶核酸分子的存在和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述生物样品接触：i)Cas12b蛋白，ii)针对所述靶核酸分子中的靶序列的gRNA，和iii)被切割后产生可检测信号的单链DNA报告分子，从而形成反应混合物；(b)检测所述反应混合物中产生的可检测信号的存在和/或水平，其中所述可检测信号的存在和/或水平代表所述靶核酸分子的存在和/或量。2.权利要求1的方法，所述靶核酸分子是双链DNA分子或单链DNA分子。3.权利要求1或2的方法，其中所述Cas12b蛋白是来自Alicyclobacillusacidiphilus的AaCas12b蛋白、来自Alicyclobacilluskakegawensis的AkCas12b蛋白、来自Alicyclobacillusmacrosporangiidus的AmCas12b蛋白、来自Bacillushisashii的BhCas12b蛋白、来自Bacillus属的BsCas12b蛋白、来自Bacillus属的Bs3Cas12b蛋白、来自Desulfovibrioinopinatus的DiCas12b蛋白、来自Laceyellasediminis的LsCas12b蛋白、来自Spirochaetesbacterium的SbCas12b蛋白、来自Tuberibacilluscalidus的TcCas12b蛋白，优选地，所述Cas12b蛋白是来自Alicyclobacillusacidiphilus的AaCas12b蛋白。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述Cas12b蛋白包含(1)与SEQIDNO:1-10中任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列；(2)相对于SEQIDNO:1-10中任一序列具有一或多个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或(3)SEQIDNO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，滕飞，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11