The invention provides a method for rapid isolation of endophytic fungi in tobacco, including three steps of disinfection of tissue surface of tobacco plant, slice culture, isolation, purification and preservation of endophytic fungi strains, etc. The invention adopts tissue separation method to isolate and cultivate endophytic fungi from the roots, stems and leaves of tobacco plants, so as to better explore the biodiversity of endophytic fungi in tobacco. Meanwhile, according to the tissue characteristics of tobacco materials, suitable surface disinfection time and disinfectant are selected, and a three-step elimination method of 75% ethanol (1 minute) 2.5% sodium hypochlorite (30s) 75% ethanol (1 minute) is established. Toxicity can ensure the isolation effect of endophytic fungi to the greatest extent. The characteristics and significance of the present invention lie in the establishment of a more perfect separation technology for Tobacco Endophytic Fungi to achieve a faster and more accurate separation; the present invention is of great significance for the full utilization of Tobacco Endophytic Fungi Resources and the healthy and sustainable development of tobacco agricultural production.
【技术实现步骤摘要】
一种快速分离烟草内生真菌的方法
本专利技术涉及一种快速分离烟草内生真菌的方法,属于微生物学领域。
技术介绍
植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织和器官内部或者组织间隙中的一类真菌。其与宿主植物建立了和谐的互利共生关系,是植物体微生态系统的重要组成部分。内生真菌在植物生长发育及在植物生物和非生物胁迫中发挥着重要作用,研究表明内生真菌能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性、减轻重金属对植物的不良影响等。植物内生真菌分布广泛、活性多样,已在多种植物中得到研究。此外,近年来的研究表明,生活在植物体这一特殊生态环境中的内生真菌能够与宿主发生协同进化,产生与宿主相同或相似的活性次级代谢产物,包括抑菌、抗肿瘤、促生长因子、抗氧化活性物质等,在医药、农业领域有很大的应用潜力。烟草内生真菌是与烟草(Nicotinanatabacum)有互利共生关系的生态类群,烟草内生真菌广泛分布于烟草根、茎、叶中,具有丰富的生物多样性,是烟田微生物群落的重要成员。烟草内生真菌不仅能促进烟草生长,增强抗病虫能力,提高烟草品质和抗逆性(抗病虫害、抗重金属和抗干旱胁迫),还具有降低烟草亚硝胺含量,改善烟叶品质的积极作用。因此,烟草内生真菌的研究及开发对阐明烟草内生真菌的种类、分布特点,提高烟叶品质具有重要意义。目前对烟草内生真菌研究较少,仅有一个专利涉及烟草内生真菌的分离和鉴定(一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法,公开号:CN105018351A)。其涉及的分离技术手段包括:烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化和保存。其所阐述的烟草内生真菌 ...
【技术保护点】
1.一种快速分离烟草内生真菌的方法,其特征在于:包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存,具体步骤如下:(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶;(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75%乙醇中浸泡1~2min,然后放入2.5%次氯酸钠中浸泡25~35s后,再放入75%乙醇中浸泡1~2min,最后用无菌水冲洗多次,完成表面消毒;(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底:取最后一次冲洗的无菌水,用涂布法涂布于培养基上,看是否有杂菌长出,若没有杂菌长出则消毒彻底;若有杂菌长出则消毒不彻底,需重复消毒;(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘,切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养;(5)将步骤(4)中的烟草组织与培养基放入培养箱,28℃恒温培养;(6)观察步骤(5)中烟草内生真菌生长状态,若切口处有菌丝长出,用灭菌的接种环挑取菌丝,在新的PDA培养基上划线稀释,直至获得纯培养;(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态,并对菌株编号,然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40%甘油水溶液中,‑80℃保存菌种。
【技术特征摘要】
1.一种快速分离烟草内生真菌的方法,其特征在于:包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存,具体步骤如下:(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶;(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75%乙醇中浸泡1~2min,然后放入2.5%次氯酸钠中浸泡25~35s后,再放入75%乙醇中浸泡1~2min,最后用无菌水冲洗多次,完成表面消毒;(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底:取最后一次冲洗的无菌水,用涂布法涂布于培养基上,看是否有杂菌长出,若没有杂菌长出则消毒彻底;若有杂菌长出则消毒不彻底,需重复消毒;(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘,切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养;(5)将步骤(4)中的烟草组织与培养基放入培养箱,28℃恒温培养;(6)观察步骤(5)中烟草内生真菌生长状态,若切口处有菌丝长出,用灭菌的接种环...
【专利技术属性】
技术研发人员:张鹏,李盼盼,申国明,高林,李青成,高加明,李方明,余军,
申请(专利权)人:中国农业科学院烟草研究所,
类型:发明
国别省市:山东,37
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