本发明专利技术公开HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。本发明专利技术的优点在于：HtrA3在非小细胞肺癌发生发展中的生物学意义，以及它参与调控肿瘤侵袭转移的潜在机制目前未有报道，本发明专利技术为治疗非小细胞肺癌，尤其是TGF‑β1相关通路活化状态的进展期非小细胞肺癌提供了新思路、新靶点。
Application of HtrA3 protein in preparation of drugs for non-small cell lung cancer
The invention discloses the application of HtrA3 protein in the preparation of drugs for treating non-small cell lung cancer. The advantages of the present invention lie in: the biological significance of HtrA3 in the occurrence and development of non-small cell lung cancer and its potential mechanism in regulating the invasion and metastasis of cancer have not been reported at present. The present invention provides a new idea and a new target for the treatment of non-small cell lung cancer, especially for advanced non-small cell lung cancer in which the activation state of the TGF_beta 1 related pathway is activated.
【技术实现步骤摘要】
HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用
本专利技术属于生物基因
，更具体地讲，涉及HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
技术介绍
肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。在我国，随着工业化速度加快、环境污染严重、人口老龄化加剧，肺癌的癌症负担日益加重。肺癌组织学分类中约80％为非小细胞肺癌，相当一部分患者在发现时已存在局部病灶播散或远处转移，5年生存率不足20％。这提示改善非小细胞肺癌患者预后的关键在于有效地抑制肿瘤侵袭转移。因此，针对肺癌转移机制的研究以及潜能药物靶点的探索具有重要的科学意义。HtrA3是HtrA丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，参与了细胞生长、凋亡、运动及炎症反应等重要过程。早期研究证实HtrA3与胚胎发育和胎盘形成相关，它可负性调控胚胎滋养层细胞的侵袭运动。近些年来的文献报道显示，该蛋白在子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、恶性甲状腺瘤等不同类型肿瘤中表达下调，推测其或可作为抑癌基因对肿瘤细胞生物学功能发挥重要的调控作用。有研究发现HtrA3蛋白高表达可促进肿瘤细胞凋亡，并增强化疗药物的敏感性，但尚无关于HtrA3蛋白在肿瘤转移中的研究报道，尤其是在非小细胞肺癌侵袭转移过程中的调控作用及其潜在机制的报道。鉴于该研究内容的重要性及迫切待解决性，我们尝试从临床标本的检测出发，寻找HtrA3与TGF-β1，这一介导晚期非小细胞肺癌侵袭转移及上皮-间质转化过程的重要蛋白间是否存在相关性。继而通过一系列体内、体外实验阐明HtrA3在TGF-β1信号通路中的调控作用。本次研究结果为针对非小细胞肺癌侵袭转移的分子靶向药物治疗提供了理论基础和新的思路。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。本专利技术的第二个目的在于提供HtrA3蛋白在制备抑制非小细胞肺癌侵袭转移药物中的应用。为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：HtrA3蛋白在制备抑制非小细胞肺癌侵袭转移药物中的应用。所述HtrA3蛋白的序列如SEQIDNo.1所示(HightemperaturerequirementA3，geneID94031，由453个aa编码)；在非小细胞肺癌肿瘤组织中，HtrA3蛋白表达与TGF-β1呈负相关，HtrA3高表达可抑制TGF-β1介导的肿瘤侵袭转移行为，从而改善预后。本专利技术提供了HtrA3在抑制非小细胞肺癌侵袭转移方面的新应用，HtrA3蛋白为对抗肺癌侵袭转移提供了新的治疗靶点。过表达HtrA3可显著抑制体外肺癌细胞中TGF-β1介导的侵袭及转移运动；过表达HtrA3可显著减少体内肿瘤细胞中TGF-β1介导的转移；HtrA3对侵袭转移的能力是通过下调SMAD2/3的磷酸化，从而抑制TGF-β1介导的上皮-间质转化过程而实现的。HtrA3可作为一靶点在制备抑制非小细胞肺癌侵袭转移的产品或药物中应用，包括：通过单克隆抗体、小分子化合物激活HtrA3蛋白活性，或促进HtrA3蛋白表达的单抗、小分子化合物。本专利技术的优点在于：HtrA3在非小细胞肺癌发生发展中的生物学意义，以及它参与调控肿瘤侵袭转移的潜在机制目前未有报道，本专利技术为治疗非小细胞肺癌，尤其是TGF-β1相关通路活化状态的进展期非小细胞肺癌提供了新思路、新靶点。附图说明图1.非小细胞肺癌组织中HtrA3与TGF-β1表达呈负相关，1A、1B免疫组化证实，非小细胞肺癌组织标本中HtrA3与TGF-β1表达呈负相关。图2.HtrA3对非小细胞肺癌细胞系中TGF-β1介导的迁移和侵袭的影响，2Awesternblot证实，成功构建稳定高表达HtrA3的A549细胞系和H358细胞系；2B划痕实验证实，A549细胞高表达HtrA3抑制了TGF-β1介导的细胞迁移；2C划痕实验证实，H358细胞高表达HtrA3抑制了TGF-β1介导的细胞迁移；2DTranswell实验证实，A549细胞高表达HtrA3抑制了TGF-β1介导的细胞侵袭。图3.HtrA3对TGF-β1介导的4T1细胞体内转移的影响，3A、3Cmicro-PET/CT证实，在小鼠体内，高表达HtrA3的4T1细胞转移瘤负荷值明显低于对照组；3B、3D剖取小鼠肺组织，HtrA3高表达组肺表面转移性结节数目明显少于对照组。图4.HtrA3抑制TGF-β1介导的侵袭转移的潜在机制，4A细胞形态学实验证实，高表达HtrA3的A549和H358细胞在TGF-β1作用下，上皮-间质转化受到部分抑制；4Bwesternblot证实，HtrA3高表达抑制了TGF-β1下游smad2/3的活化，以及slug、snail转录因子的表达；4C免疫荧光证实，高表达HtrA3的A549细胞在TGF-β1作用下，上皮-间质转化受到部分抑制。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及慢病毒载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本专利技术不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.非小细胞肺癌组织中HtrA3与TGF-β1表达情况150例临床非小细胞肺癌手术切除标本制成组织芯片，采用免疫组织化学方法分别检测HtrA3和TGF-β1蛋白表达。其中一抗分别使用特异性针对HtrA3(1:100稀释)和TGF-β1(1:100稀释)的抗体。完成显色、水洗、蜡化、脱水、封片等一系列步骤后由两名病理科专家行双盲、独立评阅。染色评分根据染色强度和肿瘤细胞染色比例综合评定。①染色强度打分标准：0未染色、1弱阳性、2中等阳性、3强阳性；②染色比例打分标准：0无染色阳性细胞1染色阳性细胞比例为1—10％2染色阳性细胞比例为11—50％3染色阳性细胞比例为51—80％4染色阳性细胞比例为81—100％综合评分结果为染色强度分数乘以染色比例分数，范围为0—12分。人为划分高表达(≥6分)和低表达(＜6分)，经统计发现，96例高表达TGF-β1的组织中，89(92.7％)例同时低表达HtrA3；而54例低表达TGF-β1的组织中，31(57.4％)例高表达HtrA3，即两者表达呈负相关性(p<0.001)。实施例2.HtrA3对非小细胞肺癌细胞系中TGF-β1介导的迁移和侵袭的影响HtrA3蛋白包含长、短两种异构体(分别为49kDa和39kDa)，基于以往文献报道，长异构体的生物功能性更为确切。利用pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-T2A-Puro(H103)慢病毒载体构建携带HtrA3基因序列(长异构体序列)的慢病毒，并分别体外转染A549和H358非小细胞肺癌细胞株。A549-NC和H358-NC中HtrA3正常表达，而A549-HtrA3和H358-HtrA3中HtrA3稳定高表达(图2A)。将细胞按一定数量接种于六孔板内，细胞过夜贴壁本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.HtrA3蛋白在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。2....
【专利技术属性】
技术研发人员：瞿介明，赵婧雅，张静，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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