一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，特点是包括以下步骤：（1）目标物经水溶液提取后，通过大粒径硅藻土柱可实现水的快速吸附，乙腈作为洗脱液逐级渗入，替换掉水溶液的同时，完成了9种常见注水类药物及代谢物的同步净化、浓缩过程；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；（3）经Hypersile Gold C18色谱柱，乙腈‑水为流动相梯度洗脱，通过采集目标物的高准确度质量数并自动触发二级，从而实现9种目标物的快速筛查；（4）通过基质标准曲线计算待测物浓度，优点是一次前处理完成水溶性药物的同时提取、净化、浓缩过程，检测灵敏度高、重现性、分辨率高且可操作性强。

A Simultaneous Detection Method for Residues of 9 Water Injection Drugs in Pork

The invention discloses a method for simultaneously detecting nine kinds of water injection drug residues in pork, which comprises the following steps: (1) After the target substance is extracted from the water solution, the rapid adsorption of water can be realized through a large-size diatomite column, and acetonitrile is infiltrated step by step as eluent, replacing the water solution, while simultaneously purifying and concentrating nine kinds of common water injection drugs and metabolites are completed. (2) Composition of mixed standard solution and preparation of matrix standard curve; (3) gradient elution of acetonitrile and water as mobile phase by Hypersile Gold C18 column. Rapid screening of nine target substances can be achieved by collecting high accuracy mass numbers of target substances and triggering secondary automatically; (4) calculation of the concentration of the target substance by matrix standard curve, with the advantage of completing water pretreatment at one time. The process of extracting, purifying and concentrating soluble drugs at the same time has high sensitivity, reproducibility, high resolution and operability.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法
本专利技术属于分析化学领域，尤其是涉及一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法。
技术介绍
我国作为猪肉消费大国，肉制品的安全直接关系到民生建设，国家及监管部门对猪肉安全监测也愈加重视。近些年，出现的“注水肉”问题与不法分子使用新型注水药有直接关系，主要包括：阻断M胆碱受体的抗胆碱药（阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱）、局部麻醉药类（普鲁卡因、利多卡因），抗组胺类药物（异丙嗪）和肾上腺素受体激动药（肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸）。其中，阻断M胆碱受体的抗胆碱药能够抑制牲畜腺体分泌，使其因干渴大量饮水从而增加其重量，牟取暴利。抗组胺类药物（异丙嗪），作为一种镇定剂，能兴奋摄食中枢，增加动物采食和饮水而增加体重；另外，同时与肾上腺素共同使用产生“肾上腺素作用翻转”现象，使得血管舒张作用充分表现，实现最大限度增加注水量。局部麻醉药类（普鲁卡因、利多卡因）可降低猪肉宰杀和运输过程中挣扎导致的脱水。非法使用此类药物会使其原形和代谢产物不可避免地残留于动物源食品中，食品后会对人体中枢神经系统等造成不良影响。目前有关猪肉注水类药物的测定方法还较少，尚无同时测定猪肉基质中9种注水类药物及其代谢物的文献报道。已有文献多是按照某一类药物建立的，适应范围单一，大部分研究局限于法医学方面。因此，建立猪肉中多类注水药的高通量筛查方法，对提高监管工作效率、保障猪肉食品安全具有重要的意义。注水类药物检测主要涉及两方面技术：前处理技术和仪器分析。由于动物源性食品种类多、基质复杂，标准方法和文献报道多数采用固相萃取柱净化，其步骤复杂、实验成本高。例如，王海燕等对畜肉中5种阿托品类药物残留量同时筛查，前处理采用磷酸盐缓冲溶液超声提取，MCXSPE小柱净化；胡海山等对动物源性食品中镇静剂类药物残留量测定，用乙腈作为提取液，OasisHLB固相萃取柱净化；另外，段科等对生肉中的阿托品类进行检查，乙腈超声提取后正己烷除油净化。乙腈作为提取液，对上述水溶性物质的提取，特别是猪肉体内水滞留性药物的提取效果不佳，不能保证强极性化合物的回收率。如何把极性物质从水溶液中有效提取出来，这始终是一个艰巨的挑战。目前，仪器方法主要涉及液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-串联质谱联用法等。国内外检测低浓度水平的药物残留通常采用的检测方法为LC-MS/MS法和GC-MS法，其中LC-MS/MS法数据通量大，无需衍生化且定性能力强，是一种灵敏度与和选择性极高的检测手段。随着质谱的发展和推广，一次进样完成多类残留分析已成为可能。药物残留正逐渐由液相色谱-三重四级杆质谱（LC-MS/MS）目标型检测向高分辨质谱（HRMS）进行精确质量非目标型全扫描检测转变。传统的LC-MS/MS在定量分析上具有优势，但分析化合物数量有限，只能针对方法中涵盖的物质，并需要逐个进行参数优化，耗时且对基质干扰敏感，相应的前处理也就更为复杂；而且分辨率低，不能有效区分相对分子质量相近的化合物，会造成假阳性结果等。全扫描高分辨质谱仪则不需要待测化合物的特征离子碎片，直接采集高准确度质量数（m/z200，分辨率70，000），对待测样品进行全扫描并自动触发二级，需要增加目标化合物时，不必再次进样，重新分析已有的全扫描数据即可。在高分辨率下采集的数据降低了近似质量数的干扰，更好地避免了假阳性的发生。通过多级扫描，建立二级谱图数据库，特别适合高通量的检测筛查。目前，国内外还没有公开一种同时检测猪肉中上述9种注水类药物残留的方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，该方法一次前处理完成水溶性药物的同时提取、净化、浓缩过程，检测灵敏度高、重现性、分辨率高且可操作性强。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，包括以下步骤：（1）样品前处理将待测样品按5g：10mL的比例加入到提取液中，振荡、超声各4-6min，4000-5000r/min下离心4-6min；取8-12mL水相上填充量为1000mg的硅藻土柱后平衡5min，然取10mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2-3次，收集洗脱液并加入0.5mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20mL；取出10mL，氮吹后用纯水定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待分析；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备A．混合标准溶液组成：混合标准溶液1包括：0.5ug/mL肾上腺素、0.5ug/mL4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和1.0ug/mL3,4-二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01ug/mL异丙嗪、0.01ug/mL阿托品、0.01ug/mL山莨菪碱、0.01ug/mL东莨菪碱、0.01ug/mL普鲁卡因和0.01ug/mL利多卡因；B．基质标准曲线定量：在空白样品中分别加入上述两种混合标准溶液1：0μL，10μL，20μL，50μL，100μL，加入上述混合标准溶液2：5.0μL，10μL，50μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值=标准品峰面积/标准品质量；（3）色谱条件与质谱条件A．色谱柱：HypersileGoldC18，柱温40℃；流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：乙腈溶液，梯度见下表1；进样量为10μL，洗脱总时间为10min，流动相流速为0.3mL/min；表1正、负离子模式HPLC洗脱程序；B．质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z100-500，分辨率70000，自动增益控制目标值5×105；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸采用负离子模式2700V，其余成分则采用正离子模式3800V，离子传输管温度为300℃，鞘气压（N2）35arb，辅助气压（N2）10arb，气化室温度350℃；二级采用自动触发模式，分辨率35000，自动增益控制目标值2×105，碰撞能量范围25%-40%，保留时间采集范围：根据色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0min；（4）浓度计算方法样品中待测物的含量根据如下计算公式得到：X=2*C*V/m，式中：X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/LV—定容体积，单位为mL；m－试样体积或质量，单位为g。步骤（1）中所述的提取液的配制方法如下：将草酸溶于水配制成浓度为8.6g/L的草酸溶液，用氨水调pH至4.0。步骤（1）中取10mL水相上填充量为1000mg的硅藻土柱。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，建立了猪肉中常见的9种注水类药物：肾上腺素及代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸，异丙嗪，阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的快速分析方法。目标物经水溶液提取后，通过大粒径硅藻土柱可实现水的快速吸附，乙腈作为洗脱液逐级渗入，替换掉水溶液的同时，完成了9种常见注水类药物及代谢物的同步净化、浓缩过程，经HypersileGoldC18(100mm×2.1mm1.9μm)色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）样品前处理将待测样品按5g：10 mL的比例加入到提取液中，振荡、超声各4‑6 min，4000‑5000 r/min下离心4‑6 min；取8‑12mL水相上填充量为1000 mg的硅藻土柱后平衡5 min，然取10 mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2‑3次，收集洗脱液并加入0.5 mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20 mL；取出10 mL，氮吹后用纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm 滤膜，待分析；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备A．混合标准溶液组成：混合标准溶液1包括：0.5 ug/mL肾上腺素、0.5 ug/mL 4‑羟基‑3‑甲氧基‑扁桃酸和1.0 ug/mL 3,4‑二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01 ug/mL异丙嗪、0.01 ug/mL阿托品、0.01 ug/mL山莨菪碱、0.01 ug/mL东莨菪碱、0.01 ug/mL普鲁卡因和0.01 ug/mL利多卡因；B．基质标准曲线定量：在空白样品中加入上述混合标准溶液1：0 μL，10 μL，20 μL，50 μL，100 μL，加入上述混合标准溶液2：5.0 μL，10 μL，50 μL，100 μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值=标准品峰面积/标准品质量；（3）色谱条件与质谱条件A．色谱柱：Hypersile Gold C18，柱温40℃；流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：乙腈溶液，梯度见下表1；进样量为10 μL，洗脱总时间为10 min，流动相流速为0.3 mL/min；表1 正、负离子模式HPLC洗脱程序...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）样品前处理将待测样品按5g：10mL的比例加入到提取液中，振荡、超声各4-6min，4000-5000r/min下离心4-6min；取8-12mL水相上填充量为1000mg的硅藻土柱后平衡5min，然取10mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2-3次，收集洗脱液并加入0.5mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20mL；取出10mL，氮吹后用纯水定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待分析；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备A．混合标准溶液组成：混合标准溶液1包括：0.5ug/mL肾上腺素、0.5ug/mL4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和1.0ug/mL3,4-二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01ug/mL异丙嗪、0.01ug/mL阿托品、0.01ug/mL山莨菪碱、0.01ug/mL东莨菪碱、0.01ug/mL普鲁卡因和0.01ug/mL利多卡因；B．基质标准曲线定量：在空白样品中加入上述混合标准溶液1：0μL，10μL，20μL，50μL，100μL，加入上述混合标准溶液2：5.0μL，10μL，50μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值=标准品峰面积/标准品质量；（3）色谱条件与质谱条件A．色谱柱：HypersileGoldC18，柱温40℃；流动相A...

【专利技术属性】
技术研发人员：李双，陈树兵，方科益，曹苏仙，徐旭文，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33