一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，属于食品安全快速检测技术领域。该方法是将阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠，然后利用获得的免疫磁珠对置于捕获体系中进行捕获，并利用LAMP方法进行扩增检测。本发明专利技术方法可以快速、高效的捕获并富集阪崎克罗诺杆菌，尤其是在纯培养物和乳制品中，改善了传统前增菌过程的弊端，大大缩短了增菌时间，耗时短，同时为各种病原体的检测提供了新的前处理方法。且LAMP方法具有操作简便，特异性强、灵敏度高等优点，为实现快速检测阪崎克罗诺杆菌领域提供了参考。

A Rapid Detection Method of Cronobacter Sakazakii by Immunomagnetic Capture

The invention discloses a method for rapid detection of Cronobacter sakazakii by immunomagnetic capture, belonging to the technical field of food safety rapid detection. In this method, the monoclonal antibody of Cronobacter sakazakii was covalently coupled with carboxyl magnetic beads to obtain immunomagnetic beads, which were then captured in the capture system and amplified by LAMP. The method of the invention can capture and enrich Cronobacter sakazakii quickly and efficiently, especially in pure culture and dairy products, which improves the disadvantages of the traditional pre-enrichment process, greatly shortens the enrichment time and consumes less time, and provides a new pre-treatment method for the detection of various pathogens. The LAMP method has the advantages of simple operation, strong specificity and high sensitivity, which provides a reference for the rapid detection of Cronobacter sakazakii.

【技术实现步骤摘要】
一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法
本专利技术涉及一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，属于食品安全快速检测

技术介绍
阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)，原阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)，隶属于肠杆菌科，氧化酶阴性、兼性厌氧、革兰氏阴性、周生鞭毛可运动。是一种条件性致病菌，主要引起新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症，其主要污染来源为婴儿配方粉，而其对于婴幼儿的致死率又高达80％。我国食品安全国家标准规定，阪崎克罗诺杆菌在婴儿配方粉中不得检出，这使得建立一种能够快速有效的阪崎克罗诺杆菌的检测方法具有重大意义。传统的检测阪崎克罗诺杆菌的方法包括传统微生物培养法和分子生物学检测方法。然而，传统检测方法检测周期长达一周左右，费时费力；而分子生物学方法依赖专业的仪器设备和复杂的人工操作。两种均不适用于现场检测，对于从源头上控制阪崎克罗诺杆菌的传播起不到很好的作用。现有的免疫学检测方法以及一些新型检测技术都需要经过较长的前增菌过程，这也是现阶段影响食品安全快速检测领域发展的瓶颈之一。所以开发一种灵敏度高、特异性好、操作简便、省时省力的方法是现阶段研究的重点。免疫磁珠由磁性载体微球和免疫配基结合而成。免疫微球通过表面的氨基、羧基等功能集团共价偶联免疫活性物质，从而具有特异性结合目标分子的能力。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，简称LAMP)发展迅速，其针对目的基因的六个区域设计4条特异性引物(两条外引物和两条内引物)，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下，1h内即可实现核酸的高效扩增。LAMP技术操作简单，快速省时，特异性强，灵敏度高，无需特殊设备，鉴定简便，已广泛用于阪崎克罗诺杆菌的检测。现有检测阪崎克罗诺杆菌的方法，检测灵敏度不够高，检测时间长，不适合于现场快速检测。
技术实现思路
为解决现有检测阪崎克罗诺杆菌的方法，检测灵敏度不够高，检测时间长，不适合于现场快速检测的问题，本专利技术提供了一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，该方法是将阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠，然后将获得的免疫磁珠对置于捕获体系中进行捕获，并利用环介导等温扩增反应进行检测。本专利技术利用免疫磁捕获快速检测克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；(2)抗体的偶联：将活化的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；(3)菌体的捕获：将获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；(4)利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，得到提取物；(5)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；所述LAMP扩增反应的引物组如SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示；(6)取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测，若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中含有阪崎克罗诺杆菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中不含有阪崎克罗诺杆菌。进一步地，步骤(1)是将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，然后再按照羧基磁珠与EDC溶液的质量比为5:2.5～5:7.5进行活化，室温下振荡后获得活化的羧基磁珠。更进一步地，所述超声为200w，10min。更进一步地，所述羧基磁珠与EDC溶液质量比为5:6，该条件下效果最好。进一步地，步骤(2)是将活化的羧基磁珠磁分离后重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液的质量比为1:1～5:2进行共价偶联，室温下振荡过夜，然后用PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠。更进一步地，所述MEST溶液为含有0.02％v/vTween-20的MES溶液，pH为6.5。更进一步地，所述羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液质量比为5:4，该条件下效果最好。进一步地，步骤(3)是向每400μL的捕获体系加入50μL～100μL免疫磁珠，捕获60min，所述捕获体系为阪崎克罗诺杆菌纯培养物或乳制品。更进一步地，步骤(3)所述免疫磁珠的添加量为每400μL捕获体系中添加75μL，该条件下效果最好。进一步地，步骤(5)所述LAMP扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：外引物与内引物的浓度比为1:4～1:9，LF引物0.6μM，LB引物0.6μM，10×Buffer2μL，dNTPs0.4μM～2.4μM，MgSO40μM～6μM，Bst2.0DNA酶(8U)1μL，模板DNA2μL，加入ddH20至25μL；LAMP扩增条件为：64℃1h，80℃2min终止反应。更进一步地，外引物与内引物的浓度比为1:8，其中外引物终浓度为0.2μM，内引物终浓度为1.6μM，该条件下效果最好。更进一步地，dNTPs的终浓度为1.6μM，该条件下效果最好。更进一步地，MgSO4的终浓度为4μM，该条件下效果最好。本专利技术有益效果：1、本专利技术将阪崎克罗诺杆菌的特异性抗体与羧基磁珠进行共价偶联，将特异性抗体包被于磁性颗粒表面以及抗原形成复合物，从而制备得到免疫磁珠，本专利技术方法可以快速、高效的捕获并富集阪崎克罗诺杆菌，尤其是在纯培养物和乳制品中，改善了传统前增菌过程的弊端，大大缩短了增菌时间，具有耗时短，操作简便特异性强、灵敏度高、耗时短等优点，同时在磁场的作用下，可达到分离、富集、用于后续检测的目的，本专利技术方法为实现快速检测阪崎克罗诺杆菌提供了前提条件，同时为各种病原体的检测提供了新的前处理方法。2、本专利技术利用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体制备免疫磁珠，建立了完整的免疫磁捕获体系，捕获时间仅为1小时，比传统富集方式大大缩短，能够实现短时间内对乳中阪崎克罗诺杆菌的快速富集，为致病菌的检测提供了一种全新有效的富集方式。同时，实验操作步骤简单，不需要专业技术人员，成为可以替代传统增菌方法的新技术。3、本专利技术利用LAMP检测方法进行扩增，特异性强，且针对纯培养物中阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度达到101cfu/mL，人工污染乳中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度达到100cfu/mL。附图说明图1EDC添加量的优化。图2抗体添加量的优化。图3免疫磁珠添加量的优化。图4外引物与内引物不同浓度比的优化；M：DNAMarker；1：空白对照；2～7：外引物与内引物浓度比分别为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9。图5dNTPs浓度的优化；M：DNAMarker；1：空白对照；2～7：dNTPs浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4mM。图6镁离子浓度的优化；M：DNAMarker；1：空白对照；2～8：镁离子浓度分别为0、1、2、3、4、5、6mM。图7LAMP法检测阪崎克罗诺杆菌纯培养物的灵敏度；M：DNAMarker；1：空白对照；2～12：菌浓度分别为3.7×109、3.7×108、3.7×107、3.7×106、3.7×105本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；(2)抗体的偶联：将活化的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；(3)菌体的捕获：将获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；(4)利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，得到提取物；(5)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；所述LAMP扩增反应的引物组如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；(6)取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测，若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中含有阪崎克罗诺杆菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中不含有阪崎克罗诺杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；(2)抗体的偶联：将活化的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；(3)菌体的捕获：将获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；(4)利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，得到提取物；(5)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；所述LAMP扩增反应的引物组如SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示；(6)取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测，若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中含有阪崎克罗诺杆菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中不含有阪崎克罗诺杆菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，200w超声10min后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，然后再按照羧基磁珠与EDC溶液的质量比为5:2.5～5:7...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，付世骞，李虹甫，满朝新，张雅硕，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23