抗对虾白斑病疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗对虾白斑病疫苗，其活性成分为如SEQ ID NO.1所示的蛋白，具体的，可以为含有能够表达SEQ ID NO.1所示的蛋白的重组工程菌的培养物，其制备方法为：(1)将如SEQ ID NO.2所示的合成基因Y1798G与空白载体连接获得重组载体；(2)将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，扩大培养，所得培养物经过一定方法处理即为抗对虾白斑病疫苗。本发明专利技术的抗对虾白斑病疫苗，通过饲喂对虾即可达到预防对虾白斑病的目的，具有免疫活性高、效率高、实用价值高等优点。此种方法研制的口服疫苗不仅能针对对虾等水产生物，对于其它动物的口服疫苗的研制同样是一种有效的策略。

Vaccine against white spot disease of shrimp and its preparation method

The invention discloses an anti-shrimp white spot vaccine, whose active ingredient is the protein shown as SEQ ID NO.1. Specifically, it can be a culture containing recombinant engineering bacteria capable of expressing the protein shown as SEQ ID NO.1. The preparation method is as follows: (1) the recombinant vector is obtained by connecting the synthetic gene Y1798G shown as SEQ ID NO.2 with the blank vector; (2) the recombinant vector is introduced into the host. The successful transformants were selected and cultured extensively. The cultures obtained were treated by certain methods to be the vaccine against white spot disease of shrimp. The anti-white spot vaccine of the invention can prevent white spot disease of shrimp by feeding shrimp, and has the advantages of high immune activity, high efficiency and high practical value. The oral vaccine developed by this method can not only target shrimp and other aquatic products, but also be an effective strategy for the development of oral vaccine for other animals.

【技术实现步骤摘要】
抗对虾白斑病疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种抗对虾白斑病疫苗，及其制备方法，属于免疫

技术介绍
虾白斑综合症病毒(wssv)是对全球养殖对虾危害最大的病毒，毒力极强，感染宿主后致死率高达90～100％。对虾一般感染后48小时出现白斑，4天内死亡率达100％。这严重影响了对虾的产量以及对虾养殖用户的热情。WSSV除能感染大多数虾品种外，还能感染非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、龙虾类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物，这些动物中多数感染WSSV而不出现特殊病理症状，可在海洋生态系统充当WSSV传播的中间宿主，给对虾养殖和野生甲壳纲动物资源构成严重威胁，其疫情至今尚未得到有效控制。现有技术中防治对虾白班症病毒通常采用治疗性疫苗，包括灭活疫苗和减毒疫苗，但都存在不少缺陷。相比之下，利用基因工程技术生产对虾白斑综合征病毒新疫苗是今后的研究的方向。利用基因工程技术所生产的疫苗包括亚单位疫苗、肽疫苗、DNA疫苗、活体重组疫苗等。目前关于对虾白斑病症病毒的亚单位疫苗的研究主要集中在wssv的囊膜蛋白VP28，VP19和被膜蛋白VP26组成的单价抗原亚单位疫苗或双价抗原亚单位疫苗，而相关报道证明双价或多价抗原亚单位疫苗比单价抗原亚单位疫苗对白斑综合症病毒有更好的预防作用。表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的表位，将其作为一种疫苗使用，属于亚单位疫苗的范畴。抗原表位又称为抗原决定簇(AD)，抗原分子中抗原特异性的化学基团，它能够与T细胞抗原受体TCR或B细胞抗原受体BCR特异性结合，最终刺激机体的免疫反应。专利
技术实现思路
针对上述现有技术，鉴于目前国内外对WSSV疫苗的研究近况，融合申请人的研究，本专利技术提出了创新性的抗对虾白斑症病毒疫苗研发思路，即利用目前有研究证实与WSSV感染与致病力有关的重要决定因子囊膜蛋白VP28、VP19和被膜蛋白VP26，从这三种蛋白基因中筛选表位基因，利用基因工程手段，组成串联的表位基因，利用基因载体生产抗原表位蛋白，最终通过合适的渠道生产具有预防和治疗效应的疫苗。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种抗对虾白斑病疫苗，其活性成分为氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白：MGPKKDSDSDTDKDTDDDDDTANDNDDEDKYKNRTSYPKRRQTKTIETHTDNIETIRNGKSDAQMKEENTSRKINITGMQMVPKINPSKAFVGSSNTSSYSGTETERGERSYNTPGLSDKDMKTAPRTDPAGTGAENSIKGNTMSSKDIKSSSSEDGAAFDEIKKK；如SEQIDNO.1所示。一种抗对虾白斑病疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将合成基因Y1798G(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)与空白载体PET-32a连接获得重组载体；(2)将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，筛选出高表达菌株，扩大培养，所得培养物即作为抗对虾白斑病疫苗(培养物中含有氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白)；进一步地，对培养物进行提取纯化得到目的蛋白或热灭活处理；具体应用时，将培养物或目的蛋白通过低温喷涂技术的处理，按照一定的配比添加到虾饲料中即可。进一步地，所述步骤(1)中，获得重组载体的具体方法为：利用限制性内切酶NcoI、BamHI分别对合成基因Y1798G、空白载体PET-32a进行双酶切，然后连接，得到重组载体。所述双酶切体系如下：合成基因Y1798G的双酶切体系(25ul体系)：10×NEBbuffer3.1，2ul；Y1798Gplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH2O，7ul；37℃，温育2h；空白载体PET-32a的双酶切体系(25ul体系)：10×NEBbuffer3.1，2ul；PET-32aplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH2O，7ul；37℃，温育2h。所述连接体系(20ul体系)如下：10×T4DNA连接反应缓冲液，2ul；T4DNA连接酶，1ul；带切口的载体PET-32a，4ul；目的DNA片段Y1798G，6ul；灭菌水，7ul；连接反应混合液于16℃，反应30～50分钟，后置4℃备用。优选的，所述步骤(2)中，宿主为大肠杆菌。进一步地，所述步骤(2)中，将重组载体导入宿主的具体方法为：取重组载体，加入到BL21(DE3)感受态中，轻弹混匀，冰上放置30分钟，置42℃水浴中热激90s,迅速转移至冰上放置3分钟，加入890ul新鲜的soc培养基，摇床培养1h，37℃；取50ul涂布于含有终浓度为100ug/ml氨苄的平板上，倒置过夜(10～14h)培养；可在含有氨苄的平板上生长的单菌落即为转化成功的转化子。进一步地，所述步骤(2)中，扩大培养的具体方法为：①挑取在含有氨苄的平板上生长的单菌落，于新鲜的含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基上划线活化，37℃过夜(10～14h)培养，获得单克隆；②挑取上述单克隆，接种于新鲜的含有终浓度100μg/ml的氨苄青霉素的LB中，37℃，220rpm培养5～6小时，使菌达到对数期生长期；③取上述培养到对数期的菌液，按照1％(体积比)的接种量转接于新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素、1％(质量百分数)葡萄糖的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，待菌液OD600达到0.6～1.0时，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，20～40℃诱导培养3～30h。优选的，所述步骤(2)中，对培养物进行处理的具体处理方法为：于4℃～8℃,3000～5000rpm离心10～20min，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，离心后重新收集菌体，加入原体积约1/4～1/3体积的PBS重悬菌体，加入终浓度为1mM的PMSF，0.5mM的溶菌酶，2ul的DNaseI,冰浴中放置1～2h左右。置冰浴中，超声破碎20～40min，直至90％以上的菌体破碎。破碎的菌液，于4℃～8℃，经6000～8500rpm离心10～30min,收集上清，利用NiSepharose吸附柱及脱盐等操作纯化回收上清中的目的蛋白；或：于4℃～8℃,离心，收集菌体，加入原体积或1.5～2倍原体积的PBS缓冲液洗涤菌体，4℃，离心后重新收集菌体，加入原体积约1/3～1/4体积的PBS重悬菌体，于65～80℃热灭活10～20min。进一步地，为验证培养物中是否含有目的蛋白，以及研究其性能，对培养物中的目的蛋白进行提取纯化，提取纯化的具体方法为：(a)提取：①上述扩大培养得到的菌液，于4℃～8℃，3000～5000rpm离心10～30min，收集沉淀，去上清；②向上述得到的沉淀中加入菌液原体积(即步骤①中离心处理前的菌液的体积)1.5～2倍的PBS缓冲液以洗涤菌体，4℃～8℃，3000～5000rpm离心10～20min，弃上清，收集菌体；③向上述得到的菌体中加入菌液原体积1/4～1/3的PBS缓冲液重悬菌体，再加入终浓度为1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，0.5mM的溶菌酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗对虾白斑病疫苗，其特征在于：其活性成分为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种抗对虾白斑病疫苗，其特征在于：其活性成分为氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白。2.根据权利要求1所述的抗对虾白斑病疫苗，其特征在于：为含有能够表达氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白的重组工程菌的培养物。3.一种抗对虾白斑病疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的合成基因Y1798G与空白载体连接获得重组载体；(2)将上述重组载体导入宿主，挑选转化成功的转化子，筛选表达量高的菌株，扩大培养，所得培养物经常规方法处理即为抗对虾白斑病疫苗的有效成分。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述空白载体为载体PET-32a；获得重组载体的具体方法为：利用限制性内切酶NcoI、BamHI分别对合成基因Y1798G、空白载体PET-32a进行双酶切，然后连接，得到重组载体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述双酶切体系如下：合成基因Y1798G的体系：10×NEBbuffer3.1，2ul；Y1798Gplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH2O，7ul；37℃，温育2h；空白载体PET-32a的体系：10×NEBbuffer3.1，2ul；PET-32aplasmid，15ul；NcoI，0.5ul；BamHI，0.5ul；ddH2O，7ul；37℃，温育2h；所述连接体系如下：10×T4DNA连接反应缓冲液，2ul；T4DNA连接酶，1ul；带切口的载体PET-32a，4ul；目的片段DNA，6ul；灭菌水，7ul；连接反应混合液于16℃，反应30～50分钟，后置4℃备用。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，宿主为大肠杆菌；或/和：所述步骤(2)中，将重组载体导入宿主的具体方法为：取重组载体，加入到BL21(DE3)感受态中，轻弹混匀，冰上放置30分钟，置42℃水浴中热激90s，迅速转移至冰上放置3分钟，加入890ul新鲜的soc培养基，摇床培养1h，37℃；取50ul涂布于含有氨苄的平板上，倒置过夜培养；可在含有氨苄的平板上生长的单菌落即为转化成功的转化子。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国华，董慧芹，
申请(专利权)人：潍坊麦吉迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37