一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用，该多肽是氨基酸序列为Val‑Glu‑Arg‑Gly‑Arg‑Arg‑Ile‑Thr‑Ser‑Val和Phe‑Val‑Ile‑Glu‑Pro‑Asn‑Ile‑Thr‑Pro‑Ala的混合物。本发明专利技术首先对榨油后的废弃物核桃粕进行脱脂处理，然后采用连续提取法，依次利用纯水、稀盐溶液、乙醇溶液和稀酸溶液从脱脂核桃蛋白中提取核桃谷蛋白‑1，再以核桃谷蛋白‑1为原料，采用限制性酶解技术、凝胶色谱分离、反向高效液相色谱纯化等技术制备出对ACE活性抑制率达92％以上的核桃粕多肽。本发明专利技术可以变废为宝，提高核桃精深加工和综合利用水平，推动核桃产业发展，产生良好的经济效益，所得多肽可作为ACE抑制剂和制备降血压药物。

A walnut meal polypeptide with ACE inhibitory activity and its preparation method and Application

The present invention discloses a walnut meal polypeptide with ACE inhibitory activity and its preparation method and application. The polypeptide is a mixture of Val Glu Arg Gly Arg Ile Thr Ser Val and He Val Ile Glu Pro Asn Ile Thr Pro Ala with amino acid sequence. The invention first degreased walnut dregs after oil extraction, and then extracted walnut glutenin 1 by walnut gluten 1 from walnut gluten protein by continuous extraction method, using pure water, dilute salt solution, ethanol solution and dilute acid solution, and then prepared with the technology of restriction enzyme, gel chromatography and reverse high performance liquid chromatography. A walnut meal polypeptide with inhibition rate of ACE activity over 92% was obtained. The invention can turn waste into treasure, improve the level of intensive processing and comprehensive utilization of walnut, promote the development of walnut industry, and produce good economic benefits. The obtained polypeptide can be used as ACE inhibitor and to prepare antihypertensive drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用
本专利技术属农产品加工
，具体涉及一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽，以及以核桃粕为原料制备该多肽的方法。
技术介绍
核桃(JuglansregiaL.)别名胡桃、羌桃，是我国重要的经济栽培树木。目前我国主栽品种有27个，栽培区域涉及26个省份，主产区为新疆、陕西、甘肃、云南、山西等省。据中国林业统计年鉴统计，2017年我国核桃年产量高达415.25万吨，按16元/千克价格计，2017年中国核桃产值达到664亿元，未来我国核桃市场前景广阔。研究表明，核桃仁中蛋白质含量约为14％～18％，可吸收率为85％，与其它植物蛋白资源相比，核桃仁蛋白质18种氨基酸齐全，8种必需氨基酸比例适宜，同时精氨酸与谷氨酸比重也相对较大，这些成分皆是人体组织细胞代谢不可缺少的重要物质，长期食用可对人体产生良好的保健效果，还可以间接降低冠心病患病风险。核桃粕是核桃仁榨油后的副产物，年产量很大，榨油后的核桃粕中营养成分含量很高，其中蛋白质高达40％～50％，是丰富的植物蛋白质资源，但目前核桃粕主要用作肥料或饲料，造成了优质蛋白资源的极大浪费。随着人们生活水平的提高，各种富贵病如高血压、高血脂、肥胖病、糖尿病等日显突出。高血压是威胁人类健康的主要疾病之一，是世界性健康问题。血管紧张素转化酶(AntiotensinIConvertingEnzyme，ACE)能催化血管紧张素I转变为具有强效升高血压作用的血管紧张素II，同时将具有降压作用的舒缓激肽降解，使之失去降压作用，通过作用于肾素-血管紧张素系统、激肽释放酶-激肽系统、血管内皮细胞系统、肾脏和体液平衡系统，最终导致血压升高。通过抑制体内ACE的活性可以起到降血压的作用，目前临床上使用的降血压药物的降压原理主要是抑制ACE的活性。但目前使用的降压药物多为化学合成，如卡托普利、雷米普利等，这些药物的降血压效果较好，但药效时间短，患者需长期服用，且副作用较大。食源性ACE抑制肽是指从食物蛋白中分离出来的、具有抑制ACE活性的多肽，其优点是降血压效果良好、无毒副作用、可添加到饮食中降低血压等，是功能性食品、医药等行业的研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽，以及以核桃粕为原料制备该多肽的方法，并为该多肽提供新的应用。针对上述目的，本专利技术所采用的核桃粕多肽是氨基酸序列为Val-Glu-Arg-Gly-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Val和Phe-Val-Ile-Glu-Pro-Asn-Ile-Thr-Pro-Ala的混合物。上述具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法由下述步骤组成：1、制备核桃粕脱脂粉将榨油后的核桃粕在40～50℃鼓风干燥箱中干燥，粉碎过60～80目筛，然后按料液比为1g﹕10～20mL加入沸程为30～60℃的分析纯石油醚，除去剩余的核桃油，得到核桃粕脱脂粉。2、提取核桃谷蛋白-1(1)按料液比为1g﹕10～30mL，向核桃粕脱脂粉中加入去离子水，室温搅拌提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤渣再反复提取3次，合并收集的滤液。(2)将步骤(1)合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入0.4～0.5mol/L的氯化钠水溶液，室温下震荡提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(3)将步骤(2)合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入体积浓度为50％～70％的乙醇水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(4)将步骤(3)合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，所得沉淀用去离子水清洗后，按料液比为1g﹕10～30mL向沉淀中加入体积浓度为40％～60％的冰乙酸水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(5)将步骤(4)合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，上清液装入截留分子量为3000～6000透析袋中，在4～6℃的蒸馏水中透析12～24小时，透析结束后，将透析液在4～10℃、8000～12000rpm的条件下离心15～20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，得核桃谷蛋白-1。3、限制性酶水解按料液比为1～4g﹕100mL，将核桃谷蛋白-1溶解于0.1～0.3mol/L磷酸缓冲液中，用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.0～3.0，加入核桃谷蛋白-1质量2％～5％的胃蛋白酶，在30～50℃下震荡酶解2～6h，将酶解液在90～100℃下灭酶5～10min；将灭酶后的酶解液在4～6℃、10000～15000rpm的条件下离心20～30min，收集上清液，冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物。4、凝胶色谱分离将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中，配制成50～150mg/mL的溶液，然后对所得溶液进行柱层析分离，柱长0.6～1.2m，直径16～26mm，固定相为SephadexG-15，纯水洗脱，洗脱流速为0.4～0.8mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，收集分离的第2个多肽组分，冷冻干燥。5、反相高效液相色谱纯化将上述凝胶色谱分离所得到的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成10～20mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，收集滤液；将滤液进行反相高效液相色谱分离，所用分离柱为碳18半制备柱，流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水，进行梯度洗脱，流动相梯度选择0到20分钟A:B为5％:95％，20～50分钟A:B为25％:75％，流速2.0～2.5mL/min，柱温30～40℃，检测波长220nm；收集分离的第5个和第8个多肽组分，冷冻干燥，得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。上述步骤2中，优选提取核桃谷蛋白-1的方法如下：(1)按料液比为1g﹕15～20mL，向核桃粕脱脂粉中加入去离子水，室温搅拌提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤渣再反复提取3次，合并收集的滤液。(2)将步骤(1)合并后的滤液在4～5℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕15～20mL向所得沉淀中加入0.4～0.5mol/L的氯化钠水溶液，室温下震荡提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(3)将步骤(2)合并后的滤液在4～5℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕15～20mL向所得沉淀中加入体积浓度为70％的乙醇水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(4)将步骤(3)合并后的滤液在4～5℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，所得沉淀用去离子水清洗后，按料液比为1g﹕15～20mL向沉淀中加入体积浓度为60％的冰乙酸水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液。(5)将步骤(4)合并后的滤液在4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽，其特征在于：所述核桃粕多肽是氨基酸序列为Val‑Glu‑Arg‑Gly‑Arg‑Arg‑Ile‑Thr‑Ser‑Val和Phe‑Val‑Ile‑Glu‑Pro‑Asn‑Ile‑Thr‑Pro‑Ala的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽，其特征在于：所述核桃粕多肽是氨基酸序列为Val-Glu-Arg-Gly-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Val和Phe-Val-Ile-Glu-Pro-Asn-Ile-Thr-Pro-Ala的混合物。2.一种权利要求1所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：(1)制备核桃粕脱脂粉将榨油后的核桃粕在40～50℃鼓风干燥箱中干燥，粉碎过60～80目筛，然后按料液比为1g﹕10～20mL加入沸程为30～60℃的分析纯石油醚，除去剩余的核桃油，得到核桃粕脱脂粉；(2)提取核桃谷蛋白-1①按料液比为1g﹕10～30mL，向核桃粕脱脂粉中加入去离子水，室温搅拌提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤渣再反复提取3次，合并收集的滤液；②将步骤①合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入0.4～0.5mol/L的氯化钠水溶液，室温下震荡提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；③将步骤②合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入体积浓度为50％～70％的乙醇水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；④将步骤③合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，所得沉淀用去离子水清洗后，按料液比为1g﹕10～30mL向沉淀中加入体积浓度为40％～60％的冰乙酸水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；⑤将步骤④合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，上清液装入截留分子量为3000～6000透析袋中，在4～6℃的蒸馏水中透析12～24小时，透析结束后，将透析液在4～10℃、8000～12000rpm的条件下离心15～20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，得核桃谷蛋白-1；(3)限制性酶水解按料液比为1～4g﹕100mL，将核桃谷蛋白-1溶解于0.1～0.3mol/L磷酸缓冲液中，用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.0～3.0，加入核桃谷蛋白-1质量2％～5％的胃蛋白酶，在30～50℃下震荡酶解2～6h，将酶解液在90～100℃下灭酶5～10min；将灭酶后的酶解液在4～6℃、10000～15000rpm的条件下离心20～30min，收集上清液，冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物；(4)凝胶色谱分离将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中，配制成50～150mg/mL的溶液，然后对所得溶液进行柱层析分离，柱长0.6～1.2m，直径16～26mm，固定相为SephadexG-15，纯水洗脱，洗脱流速为0.4～0.8mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度...

【专利技术属性】
技术研发人员：张有林，王静，张润光，张玉峰，王国良，赵爱青，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61