黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。所述磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核，以天然亲水性琼脂糖为基质，采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面，从而能够与适配体通过共价偶联的方式结合。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁性琼脂糖微球无需采用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺或戊二醛进行活化，室温下将适配体溶液与NHS磁性琼脂糖磁珠混合1～2h便可将适配体共价偶联到磁珠上。本发明专利技术的磁固相萃取材料作为一种新型磁固相萃取吸附剂将用于食品、农产品以及中药中黄曲霉毒素B1和B2的检测分析。

Material, preparation and application of magnetic solid phase extraction of aflatoxin B1 and B2

The invention provides aflatoxin B1 and B2 magnetic solid phase extraction materials, a preparation method and application. The magnetic solid phase extraction material takes superparamagnetic Fe3O4@SiO2 as its core and natural hydrophilic agarose as its matrix. The agarose is encapsulated on the surface of Fe3O4@SiO2 by composite emulsification technology, and then the NHS group is modified on the surface of agarose, so that it can be covalently coupled with the adapter. Compared with the traditional carboxyl and amino magnetic beads, magnetic agarose microspheres with NHS groups on the surface need not be activated by 1 (3 dimethylaminopropyl)3 ethylcarbodiimide or glutaraldehyde. The adaptor solution can be covalently coupled to the magnetic beads by mixing the adaptor solution with NHS magnetic agarose beads for 1-2 hours at room temperature. The magnetic solid phase extraction material of the invention as a new magnetic solid phase extraction adsorbent will be used for the detection and analysis of aflatoxin B1 and B2 in food, agricultural products and traditional Chinese medicine.

【技术实现步骤摘要】
黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用
本专利技术属于食品安全检测
，具体地说，涉及黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。
技术介绍
黄曲霉毒素B(AflatoxinB,AFB)是由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的一类结构相似的有毒次生代谢物，常见的有黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2，具有极强的致癌性、致畸性和致突变作用。其中，黄曲霉毒素B1的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，被国际癌症研究机构(IARC)划定为I类致癌物质。黄曲霉毒素B是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件下不易破坏，因此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。全世界每年约有25％的食物在生产、加工、运输、贮藏等各环节可能受到黄曲霉毒素的污染，由于黄曲霉毒素对人类身体健康危害的严重性，许多国家和国际组织已对黄曲霉毒素在食品或中药中的残留量做出了限量规定。欧盟规定花生及其制品中黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)总量不得超过4μg/kg，黄曲霉毒素B1不得超过2μg/kg。我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素的允许量标准为(B1+B2+G1+G2)不得超过10ng/g，2015版《中国药典》收载的19味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)总量不得超过10μg/kg。由于黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2危害较大，因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除基质干扰，对于监测黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的污染状况具有重要意义。目前黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法、酶联免疫吸附法，毛细管电泳法、液质联用法等。其中薄层色谱法是最早使用也是最广泛使用的检测黄曲霉毒素B2的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低、无需价格昂贵的仪器。但是，薄层色谱法的样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，存在主观影响较大，灵敏度不高等缺点，已远远不能满足现代检测要求。酶联免疫吸附法具有检测特异性好、灵敏度高、并且检测成本较低的优点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用。酶联免疫吸附法的主要问题是容易造成假阳性。因此，主要用于基层的筛查检测。高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用的食品中毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理过程，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的要求。而传统的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，且多为一次性的。因此，建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素B2检测分析中亟需解决的重要问题。适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)进行多次的富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的、与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究还处于起步阶段，但是已经表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。基于适配体的磁性琼脂糖微球是一种新型高效的样品前处理材料。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的，此法已成为真菌毒素分析的一个重要发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。本专利技术的构思如下：将高特异性、高亲和力的黄曲霉毒素B1和B2的适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基硫代琥珀酰亚胺修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到黄曲霉毒素B1和B2的特异性磁性琼脂糖微球，并将其作为磁固相萃取材料实现两种黄曲霉毒素B的高效分离和灵敏分析。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体，其核酸序列如SEQIDNO:1所示。第二方面，本专利技术提供所述核酸适配体在制备用于分离黄曲霉毒素B1和B2的材料中的应用，所述材料包括但不限于磁固相萃取材料。第三方面，本专利技术提供黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料，所述磁固相萃取材料是以Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒为内核，外面包裹有琼脂糖，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面得到磁性琼脂糖微球，再将权利要求1所述核酸适配体与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。进一步地，所述磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核，以天然亲水性琼脂糖为基质，采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面，从而将所述黄曲霉毒素B适配体特异性DNA与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。其中，用于制备黄曲霉毒素B磁固相萃取材料的所述核酸适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。优选地，所述核酸适配体是经过氨基修饰的适配体序列(3’或5’端修饰)，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)或C6间接臂(-(CH2)6-)，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。第四方面，本专利技术提供所述磁固相萃取材料的制备方法，包括以下步骤：1)Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备将1-5gFeCl3·6H2O与6-20g醋酸钠分散至180-250mL乙二醇分析纯中，搅拌均匀投入反应釜中(磁力搅拌至均一状，加入聚四氟乙烯高压反应釜中)，200-250℃下加热10-16h(优选200℃下加热10h)，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗(3-5次)后烘干，得到Fe3O4粉末；将1-5gFe3O4粉末分散至由200-1000mL无水乙醇和100-500mL去离子水组成的混合液中，超声分散10-30min，加入1-5mL氨水溶液(25％-28％)，搅拌10-30min，然后将4-15mL正硅酸四乙酯与20-100mL无水乙醇混匀后滴加至上述溶液体系中(每秒一滴)，滴加完后于室温反应过夜，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗(3-5次)后烘干，得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒；2)磁性琼脂糖微球的制备①琼脂糖溶液的配制：称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中，加热至琼脂糖完全溶解，向烧瓶中加入沸水至总体积90-200mL，摇匀后即得琼脂糖溶液；②将1-5gFe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10-50mL去离子水中，超声10-30min，得到磁流体；③称取12-20gSpan-80溶于350-500mL液体石蜡中，在300-500rpm转速下搅拌均匀，然后加热至80℃，得到有机相；④将②的磁流体加入到①的琼脂糖溶液中，80℃下反应30-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述核酸适配体在制备用于分离黄曲霉毒素B1和B2的材料中的应用，所述材料包括磁固相萃取材料。3.黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料，其特征在于，所述磁固相萃取材料是以Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒为内核，外面包裹有琼脂糖，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面得到磁性琼脂糖微球，再将权利要求1所述核酸适配体与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。4.根据权利要求3所述的磁固相萃取材料，其特征在于，所述核酸适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。5.根据权利要求4所述的磁固相萃取材料，其特征在于，所述核酸适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。6.权利要求5所述磁固相萃取材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备将1-5gFeCl3·6H2O与6-20g醋酸钠分散至180-250mL乙二醇分析纯中，搅拌均匀投入反应釜中，200-250℃下加热10-16h，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗后烘干，得到Fe3O4粉末；将1-5gFe3O4粉末分散至由200-1000mL无水乙醇和100-500mL去离子水组成的混合液中，超声分散10-30min，加入浓度为25％-28％的氨水溶液1-5mL，搅拌10-30min，然后将4-15mL正硅酸四乙酯与20-100mL无水乙醇混匀后滴加至上述溶液体系中，滴加完后于室温反应过夜，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗后烘干，得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒；2)磁性琼脂糖微球的制备①琼脂糖溶液的配制：称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中，加热至琼脂糖完全溶解，向烧瓶中加入沸水至总体积90-200mL，摇匀后即得琼脂糖溶液；②将1-5gFe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10-50mL去离子水中，超声10-30min，得到磁流体；③称取12-20gSpan-80溶于350-500mL液体石蜡中，在300-500rpm转速下搅拌均匀，然后加热至80℃，得到有机相；④将②的磁流体加入到①的琼脂糖溶液中，80℃下反应30-60min，然后将此混合液加入到③的有机相中，在600-800rpm搅拌下反应1-2h，然后降温至20℃，加入1-1.5L无水乙醇进行破乳化，所得产物用去离子水和无水乙醇反复清洗，产物用磁铁收集，将产物溶于水中配制成体积百分数50-70％v/v的溶液，即得磁性琼脂糖微球；3)NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球的制备取步骤2)制备的磁性琼脂糖微球10-30mL，加入50-150mL1M氢氧化钠溶液、30-90mL环氧氯丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪美，栾云霞，陆安祥，付海龙，郭晓军，王纪华，
申请(专利权)人：北京农业质量标准与检测技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11