一种筛选卵巢储备功能低下代谢标志物的方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选卵巢储备功能低下标志物的方法，其特征在于，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成。本发明专利技术利用HPLC‑MS加以定量分析，采用logistic回归模型，建立卵巢储备功能与差异代谢物的方程，并对各代谢物指标进行赋值，从而建立卵巢储备功能评价系统。评价只需利用HPLC测量各差异代谢物组含量，根据赋值得出总评分，判断卵巢储备功能。

A METHOD FOR SCREENING METABOLIC MARKERS OF LOW OVARIAN RESERVE FUNCTION

The invention relates to a method for screening markers of low ovarian reserve function, and is characterized in that the method comprises comparing the composition of follicular fluid metabolites between subjects with low ovarian reserve function and healthy subjects. The method uses HPLC MS to make quantitative analysis, uses logistic regression model to establish the equation of ovarian reserve function and differential metabolites, and assigns each metabolite index, thereby establishing the ovarian reserve function evaluation system. To evaluate the ovarian reserve function, we only need to measure the content of different metabolites by HPLC, and get the total score according to the endowment value.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选卵巢储备功能低下代谢标志物的方法
本专利技术涉及生殖医学领域，具体涉及一种筛选卵巢储备功能低下代谢标志物的方法。
技术介绍
卵巢储备是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精的卵母细胞的能力。此能力下降，即卵巢产生卵子能力减弱，卵母细胞质量下降，所致的生育能力下降称为卵巢储备功能低下。卵巢功能低下患者通常产生质量较差的卵泡和卵母细胞，卵母细胞的质量直接影响受精率、卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持、胎儿的发育甚至成年后的健康。因此，寻找卵巢储备功能低下生物标志物尤为重要。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后新兴起的一门科学，是系统生物学的重要组成部分。Nicholson等于1999年首次提出代谢组学概念:对受病理生理刺激或基因改变的生物体系所反应的动态代谢进行多参数定量分析。它以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，定量分析特定时期特定生理条件下细胞体系中所有的代谢物。代谢物组即指生物样本中所有的小分子代谢物，包括代谢中介物及终产物，如氨基酸、脂类、核肽、ATP等，它是细胞调节过程的终产物，理化特性广泛，反映生物体系受外部刺激所做出的变化。代谢组学具有如下特点:首先，与细胞或机体的基因和蛋白质相比，代谢物数量显著少，人类基因组大约包含2.5万个基因，编码10万-20万个转录子，翻译100万种蛋白质，却仅产生2500-3000种代谢物，故代谢组检测要比转录组或蛋白组检测简单廉价。其次，转录组及蛋白组的改变并不总是与细胞表型相关，而代谢物组是基因表达的终产物，反映了细胞的真实功能状态，可较前者更准确地评估基因功能。最后，基因过度表达等微小变化经转录组和蛋白组逐级放大后，在代谢物水平上更易被检测。因此，代谢组学从筛选难易程度上更具优势，是良好的、潜在的卵泡液内特征标志物筛选方法。
技术实现思路
根据本专利技术，提供一种筛选卵巢储备功能低下标志物的方法，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成。其中，所述方法还包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的含量。在所述方法中，可以通过核磁共振氢谱检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成差异，也可以通过GC-MS检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成及含量差异，还可以通过HPLC-MS检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成及含量差异。所述方法对检测数据进行统计学分析，有统计学差异的组分被认定为标志物。根据本专利技术的方法，被认定的标志物包括反式咖啡酰酒石酸和β-丙氨酸，进一步还包括牛磺酸、十六碳烯、油酸和焦磷酸。根据本专利技术的方法，被认定的标志物包括括N-乙酰-D-色氨酸和亚牛磺酸，进一步还包括哌啶酸、尿素和肾上腺素。附图说明图1示出根据本专利技术的实施例2所描述的技术路线；图2示出根据本专利技术的实施例3和4所描述的技术路线；图3示出根据本专利技术的实施例5所描述的技术路线。具体实施方式下面通过附图和具体实施方式对本专利技术进一步详细说明。通过这些说明，本专利技术的特点和优点将变得更为清楚明确。根据本专利技术的一个实施方式，绘制卵巢功能低下与正常卵母细胞卵泡液代谢指纹图谱，筛选差异代谢物组根据本专利技术的一个实施方式，收集卵巢功能低下和卵巢功能正常的卵母细胞卵泡液，利用H1-NMR(核磁共振氢谱)分析技术分别采集两组代谢物信息，利用偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)建模分析，运用SIMCA-P软件进行正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)处理，通过OPLS-DA模型第一主成分的VIP(variableimportanceintheprojection)值(阈值>1)，并结合Studentt检验的P值(阈值0.05)寻找差异代谢物组。并经HMDB人类代谢组学数据库进行检索，定性分析差异性代谢物。根据本专利技术的一个实施方式，采用logistic回归模型，明确卵泡液代谢标志物组与受试者卵巢储备功能之间的关系，筛选卵巢储备功能低下标志物。根据本专利技术的一个实施方式，利用HPLC-MS(高效液相色谱-质谱)技术对两组差异代谢物组进行含量测定，通过多远逐步logistic回归分析确定独立影响卵巢储备功能的差异代谢物，并赋予各代谢物反映卵巢储备功能的等级分值，据此建立卵巢储备功能评估系统。应用ROC曲线下面积评价其诊断准确性，Kappa检验评估其诊断可靠性。本专利技术的创新性在于：目前对卵泡液筛选差异代谢物研究，多数停留在代谢物对卵母细胞质量的影响并未建立卵巢储备功能评估体系。本研究利用HPLC-MS加以定量分析，采用logistic回归模型，建立卵巢储备功能与差异代谢物的方程，并对各代谢物指标进行赋值，从而建立卵巢储备功能评价系统。评价只需利用HPLC测量各差异代谢物组含量，根据赋值得出总评分，判断卵巢储备功能。实施例11.实验组卵巢功能低下患者的选择：1)诊断标准：根据文献报道关于卵巢功能低下的诊断标准进行诊断：12mIU/ml＜bFSH＜40mIU/ml，或窦卵泡数≤5-7个，或基础AMH＜1.26ug/l，或FSH/LH比值升高＞2-3.6，或bE2＞80pg/ml。2)纳入标准：①符合卵巢功能低下诊断标准。②需要行IVF-ET的不孕患者。③年龄在25-30岁之间的已婚女性。④接受IVF-ET≤2次。⑤受试者知情，自愿签署知情同意书。3)排除标准：①因子宫畸形导致不孕者②多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常等合并症的不孕症患者③有其它器官严重疾病者。④因男性因素导致不孕者。⑤接受IVF-ET≥3次。4)剔除标准①剔除：不应入组但已入组的受试者，应予剔除，包括误纳、误诊患者。不作统计分析。根据以上选取标准入组患者10例，保证每位患者年龄、身高、体重、饮食习惯最相近。2.对照组健康者的选择：对于因男性不育或女性输卵管不通原因造成的不孕，需采取辅助生殖技术的无其他疾病的患者作为卵巢功能正常的对照组。年龄要求在25-30岁之间。入组健康者10例，与患者年龄、身高、体重、饮食习惯最相近。3.卵子与卵泡液获取①卵泡的选择：经阴道B超引导下行穿刺取卵术取卵。实验组和对照组分别选取10例大小相近的卵泡提取的卵泡液作为测试样品。②卵泡液提取：分离卵母细胞于50μlHTF液中单独体外培养4h后行常规体外受精，受精后16-18h(D1)检查原核形成情况，并换液至20μlP1液中继续培养，出现双原核为正常受精。吸取卵泡液，置于低温离心机中，2000r/min离心10min，吸取上清液分装至无菌样品管，每管1ml，置-80℃冰箱中保存备用。实施例2基于NMR技术对卵泡液代谢组分分析：按照如图1所示技术路线，将2ml冻存的卵泡液置冷冻干燥机中，经过升华、干燥后，制成冻干粉，密封保存。冻干粉取1g用75％色谱甲醇沉淀，12000r/min离心10min后，取其上清液，氮气吹干，350ul重水溶解后，用Bruker800MHzNMR测定氢谱，计算积分值。运用监督分析法偏最小二乘法-辨别分析(PLS-DA)，应用SIMCA-P和MetaProc软件进行OPLS-DA处理。筛选出差异代谢物组，查找经HMDB人类代谢组学数据库进行检索，定性分析差异性代谢物。实施例3用HPLC-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选卵巢储备功能低下标志物的方法，其特征在于，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成。

【技术特征摘要】
1.一种筛选卵巢储备功能低下标志物的方法，其特征在于，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的含量。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过核磁共振氢谱检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成差异。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过GC-MS检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成及含量差异。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过HPL...

【专利技术属性】
技术研发人员：阴赪宏，王程荣，代荫梅，岳文涛，杨晓葵，洪黎明，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京妇产医院，
类型：发明
国别省市：北京,11