一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，该方法步骤如下：（1）制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；（2）制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒；（3）制备纳米微球‑氯霉素荧光探针；（4）氯霉素荧光试纸条构建和检测方法。（5）将氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；（6）将待测样品加入到步骤（5）中的酶标板的孔中；（7）向步骤（6）的酶标板孔中插入层析试纸条，得到检测结果。本发明专利技术提高了荧光探针的稳定性和灵敏度；本发明专利技术制备聚苯乙烯纳米荧光微球探针，不存在Eu(DBM)3phen泄露问题，构建的氯霉素荧光试纸条稳定性好，灵敏度高，具有巨大的商业应用价值。

A Method for Detecting Chloramphenicol Based on Polystyrene Nano-fluorescent Microsphere Probe

The invention relates to a method for detecting chloramphenicol based on polystyrene Nanofluorescent microsphere probe. The steps of the method are as follows: (1) preparation of carboxyl modified polystyrene nanoparticles; (2) preparation of fluorescent polystyrene nanoparticles; (3) preparation of nanomicrospheres chloramphenicol fluorescent probe; (4) construction and detection of chloromycetin fluorescent strip. (5) The chloramphenicol fluorescent probe was added into the pore of the enzyme label plate; (6) the sample to be tested was added into the pore of the enzyme label plate in step (5); (7) the chromatographic strip was inserted into the pore of the enzyme label plate in step (6) to obtain the test result. The invention improves the stability and sensitivity of the fluorescent probe; the polystyrene nano-fluorescent microsphere probe prepared by the invention does not have the problem of Eu (DBM) 3phen leakage; the chloromycetin fluorescent test strip constructed by the invention has good stability and high sensitivity, and has great commercial application value.

【技术实现步骤摘要】
一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法
本专利技术属于材料、生物、生物检测等交叉领域，特别涉及基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法。
技术介绍
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)又叫左旋霉素，是一种用于治疗伤寒、脑膜炎和尿路感染等疾病的酰胺醇类抗生素类药物，该药物能有效抑制炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特菌、葡萄球菌以及衣原体、立克次氏体等病原微生物。毒理学研究表明，CAP对人体具有较大的毒副作用，主要表现为：抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血、细胞减少性贫血、血小板减少和粒状白细胞减少。另外，该药物理化性质极为稳定，可通过食物链在人体内蓄积，从而对人体健康造成严重损害。稀土元素具有独特的发光特性，已被开发出多种发光材料，Eu(DBM)3phen是典型代表。与量子点等荧光转换元件相比，该物质具有发射光谱窄、Stokes位移大、荧光寿命长、可同时发射多波长荧光等特点，是理想的荧光信号。将Eu(DBM)3phen参杂到某些基体中，能顺利的得到功能化荧光基材。将Eu(DBM)3phen参杂或包埋到硅球和聚苯乙烯微球中已有文献报道。二氧化硅微球表面惰性，性质稳定，但不适合与抗体等分子识别元件偶联。羧基化的聚苯乙烯微球对Eu(DBM)3phen已有报道，如彭超(彭超.含稀土配合物的荧光编码聚苯乙烯微球的制备与表征[D].天津大学,天津，2012.)通过苯乙烯与甲基丙烯酸甲酯共聚制备出微米级微球，再经水解作用得到羧基化聚苯乙烯微球，通过溶胀法得到Eu(DBM)3phen参杂的聚苯乙烯荧光微球，该方法制备的微球直径为微米级，不适合生物探针的应用，且羧基化过程繁琐。将苯乙烯与丙烯酸共聚获得羧基化聚苯乙烯微球，避免了水解酯的步骤，但合成方法繁琐，聚合物的侧链简单，获得微球热稳定性和化学稳定性有待提高。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术解决的技术问题是针对当前缺乏快速、简便、灵敏度高、准确的检测氯霉素的方法，提供一种利用纳米荧光探针检测氯霉素的方法。该方法灵敏度高、快速、操作简便、稳定性好，可广泛推广用于氯霉素检测。技术方案一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒直径为110±5nm；(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒：取步骤(1)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8-4.2℃下磁力搅拌大于等于4小时；去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；(3)利用步骤(2)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球-氯霉素荧光探针；(4)利用氯霉素-牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；(5)将步骤(3)制备的纳米微球-氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；(6)将待测样品加入到步骤(5)中的酶标板的孔中；(7)向步骤(6)的酶标板孔中插入步骤(4)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4-5分钟后得到检测结果。步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：将甲基丙烯酸(95.5％)加入0.5％的过硫酸钾溶液中，500-600转/分钟下搅拌3-5分钟；然后加入苯乙烯(95.5％)，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在惰性气体保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；甲基丙烯酸，过硫酸钾溶液，苯乙烯之间的体积比为1:50:3；反应结束后在4500-5000rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000-12000rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤大于等于5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用。步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与十二烷基磺酸钠溶液的质量体积比为100-110mg：5mL；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液浓度为0.2-0.25％；步骤(2)中的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液浓度为0.05mol/L，pH为6.0。步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与Eu(DBM)3phen的质量比为10：0.8-1；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液与二氯甲烷溶剂的体积比为5：1-1.5。步骤(3)所述纳米微球-氯霉素荧光探针，由包括以下步骤的方法制得：将步骤2制备的荧光聚苯乙烯纳米微球2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液悬浮液超声分散10-15分钟；取10-15μL超声分散好的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮液分散于990-1000μL2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，得反应液A；迅速取10-15μL溶剂为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化溶液加入反应液A中，混匀，在18～37℃温度下，搅拌条件下活化50-60分钟；活化结束后，在10000-15000rpm条件下离心分离，固体分散于200-250μL磷酸盐缓冲液中，得反应液B；取800-900μL氯霉素抗体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到反应液B中，立即涡旋混匀，超声3-5分钟后，18～37℃温度下反应2～4小时，得反应液C；向反应液C中加入70-80μL0.2mol/L的甘氨酸，封闭1.5-2.0小时，再加入20-50μL10％牛血清白蛋白溶液，封闭10-12小时；将反应液C10000-15000rpm离心20-25分钟，收集沉淀，沉淀悬浮于1-1.5mL含有0.1％Tween-20、1％牛血清白蛋白、0.01％Procline300的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液中。步骤(4)所述的层析试纸条是在硬垫板上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维样品垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水垫，再剪成3-4毫米宽的试纸条。所述悬浮分散的过程中，辅以施加超声震动，振动频率为20KHz。所述磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器包括氮吹筒、氮气瓶和连接管路，氮吹筒的上端为敞开式，氮吹筒的下端为漏斗状，漏斗状，的下端连通有连接管路，连接管路的另一端与氮气瓶相连；连接管路为弯曲管，弯曲管最高处的高度高于氮吹筒的高度。所述氮吹筒内设有多层的多孔网，多孔网密布有大量的孔，每层多孔网之间使用支撑架支撑隔离，最上层的支撑架的上端压有重物。相邻层的多孔网的孔在竖直方向位置不相同。优点及效果本专利技术具有如下优点及有益效果：本专利技术中以甲基丙烯酸与苯乙烯共聚合制备羧基化聚苯乙烯纳米微球，由于增加了侧链的空间位阻效应，极性效应及高分子链之间的氢键作用，不但提高了纳米微球的热稳定性和化学稳定性，还增加了Eu(DBM)3phen在聚合物纳米微球中的稳定性，应用过程中不易泄露，提高了纳米微球的荧光强度和荧光探针的灵敏度和稳定性。附图说明图1为Eu(DBM)3phen掺杂的聚苯乙烯荧光纳米微球；图2为磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器示意图。附图标记说明：1.氮吹筒、2.氮气瓶、3.连接管路、4.多孔网、5.支撑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒直径为110±5nm；(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒：取步骤(1)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8‑4.2℃下磁力搅拌大于等于4小时；去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；(3)利用步骤(2)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球‑氯霉素荧光探针；(4)利用氯霉素‑牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；(5)将步骤(3)制备的纳米微球‑氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；(6)将待测样品加入到步骤(5)中的酶标板的孔中；(7)向步骤(6)的酶标板孔中插入步骤(4)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4‑5分钟后得到检测结果。...

【技术特征摘要】
1.一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒直径为110±5nm；(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒：取步骤(1)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8-4.2℃下磁力搅拌大于等于4小时；去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；(3)利用步骤(2)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球-氯霉素荧光探针；(4)利用氯霉素-牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；(5)将步骤(3)制备的纳米微球-氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；(6)将待测样品加入到步骤(5)中的酶标板的孔中；(7)向步骤(6)的酶标板孔中插入步骤(4)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4-5分钟后得到检测结果。2.根据权利要求1所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：将甲基丙烯酸(95.5％)加入0.5％的过硫酸钾溶液中，500-600转/分钟下搅拌3-5分钟；然后加入苯乙烯(95.5％)，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在惰性气体保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；甲基丙烯酸，过硫酸钾溶液，苯乙烯之间的体积比为1:50:3；反应结束后在4500-5000rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000-12000rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤大于等于5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用。3.根据权利要求1所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与十二烷基磺酸钠溶液的质量体积比为100-110mg：5mL；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液浓度为0.2-0.25％；步骤(2)中的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液浓度为0.05mol/L，pH为6.0。4.根据权利要求1所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与Eu(DBM)3phen的质量比为10：0.8-1；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液与二氯甲烷溶剂的体积比为5：1-1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤轶伟，陈金嫒，靳雨婷，任涛涛，李转英，高雪，刘秀英，励建荣，吕长鑫，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21