人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法技术

本发明专利技术提供一种人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体的制备方法，其方法是将人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3插入PGEX‑4T‑1载体，获得PGEX‑4T‑1‑SKA3原核表达载体；再通过PCR获得融合片段GST‑SKA3并插入pCMV‑HA载体，获得带HA及GST标签的SKA3真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3；培养转染了该真核表达载体的喉鳞状癌细胞Hep‑2，然后纯化获得重组GST融合蛋白。具体包括如下步骤：(1)原核表达载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建与验证；(2)真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3的构建与验证；(3)喉鳞状细胞癌Hep‑2细胞中真核表达及纯化。本发明专利技术选择GST标签可提高蛋白表达的可溶性和表达量；利用真核表达载体pCMV‑HA表达蛋白，表达时形成稳定的二硫键，对表达的蛋白进行正确折叠，并进行复杂糖基化修饰，蛋白活性接近于天然蛋白，不需去除内毒素。

Preparation of Eukaryotic Expressed Protein Monomer of Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Related Gene SKA3

The present invention provides a method for preparing eukaryotic expression protein monomer of human laryngeal squamous cell carcinoma related gene SKA3. The method is to insert human laryngeal squamous cell carcinoma related gene SKA3 into PGEX 4T 1 vector to obtain prokaryotic expression vector of PGEX 4T 1 SKA3, and then obtain fusion fragment GST SKA3 by PCR and insert pCMV HA vector to obtain SKA3 eukaryotic expression vector with HA and GST tags. HA GST SKA3; laryngeal squamous cell carcinoma Hep 2 was cultured and transfected with the eukaryotic expression vector, and the recombinant GST fusion protein was purified. Specific steps include: (1) construction and verification of prokaryotic expression vector PGEX 4T 1 SKA3; (2) construction and verification of eukaryotic expression vector pCMV HA GST SKA3; (3) eukaryotic expression and purification of laryngeal squamous cell carcinoma Hep 2 cells. The present invention chooses GST tag to improve the solubility and expression quantity of protein expression, uses eukaryotic expression vector pCMV HA to express protein, forms stable disulfide bond, folds the expressed protein correctly, and carries out complex glycosylation modification, the protein activity is close to natural protein, and does not need to remove endotoxin.

【技术实现步骤摘要】
人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法
本专利技术涉及生物技术和分子生物学
，具体涉及一种人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体的制备方法。
技术介绍
喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其中喉鳞状细胞癌居头颈部恶性肿瘤第二位，在我国北方地区高发。喉鳞状细胞癌早期易发生颈部淋巴结转移，并具有具备侵袭的恶性特征，是导致其术后复发及预后不良的主要危险因素。人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3表达上调与喉鳞状细胞癌发生发展密切相关，对肿瘤细胞增殖、侵袭及转移有不同程度的影响，获得人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3蛋白质单体对研究喉鳞状细胞癌的调控作用及机制对喉鳞状细胞癌的临床防治、疾病分子靶向治疗及预后具有重要意义。E.coli表达系统是目前应用最为广泛，也是最为经济实惠的原核蛋白表达系统。pGEX-4T-1是一个大肠杆菌表达质粒，Tac启动GST促溶标签和目的基因融合表达。一般选择GST标签可提高蛋白表达的可溶性和表达量，但由于其相对分子量较大，约为26KD，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，可利用位点特异性蛋白酶选择性去除。此外，GST标签蛋白纯化方便且温和，可在温和、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建与验证(1)根据人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列设计并合成引物(a)根据NCBI数据库人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列信息，利用软件Primer Premier 5设计并合成引物；(b)为了便于插入PGEX‑4T‑1载体，在两端引物分别引入了EcoR I和Not I的酶切位点；(2)载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建(a)以喉鳞状癌细胞Hep‑2的cDNA为模板，以Pfu酶通过PCR扩增SKA3基因序列全长并引入酶切位点EcoR I和Not I；(b)...

【技术特征摘要】
1.人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)载体PGEX-4T-1-SKA3的构建与验证(1)根据人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列设计并合成引物(a)根据NCBI数据库人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列信息，利用软件PrimerPremier5设计并合成引物；(b)为了便于插入PGEX-4T-1载体，在两端引物分别引入了EcoRI和NotI的酶切位点；(2)载体PGEX-4T-1-SKA3的构建(a)以喉鳞状癌细胞Hep-2的cDNA为模板，以Pfu酶通过PCR扩增SKA3基因序列全长并引入酶切位点EcoRI和NotI；(b)使用EcoRI、NotI双酶切SKA3的PCR产物，所得产物经胶回收纯化后与同样使用EcoRI、NotI双酶切的PGEX-4T-1载体质粒连接；(c)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；(d)挑取单克隆、无内毒素提取验证载体PGEX-4T-1-SKA3质粒，使用EcoRI、NotI双酶切载体PGEX-4T-1-SKA3质粒，核酸电泳验证，筛选阳性单克隆，获得原核表达载体PGEX-4T-1-SKA3；(3)载体PGEX-4T-1-SKA3的验证将阳性单克隆载体PGEX-4T-1-SKA3质粒送测序，检测SKA3的序列情况，验证与所选的人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列信息一致；(二)真核表达载体pCMV-HA-GST-SKA3的构建与验证(1)根据PGEX-4T-1-SKA3载体序列设计并合成引物(a)为了携带GST标签，根据PGEX-4T-1-SKA3载体的序列信息，利用软件PrimerPremier5设计并合成引物；(b)为了便于插入pCMV-HA真核表达载体，在两端引物分别引入了XhoI和NotI的酶切位点；(2)真核表达载体pCMV-HA-GST-SKA3的构建(a)以原核表达载体PGEX-4T-1-SKA3为模板，以Pfu酶通过PCR获得带XhoI和NotI酶切位点的GST-SKA3融合片段；(b)使用XhoI、NotI双酶切GST-SKA3的PCR产物，所得产物经胶回收纯化后与同样使用XhoI、NotI双酶切的pCMV-HA载体连接；(c)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；(d)挑取单克隆、无内毒素提取验证载体pCMV-HA-GST-SKA3质粒，使用XhoI、NotI双酶切载体pCMV-HA-GST-SKA3质粒，核酸电泳验证，筛选阳性单克隆，获得真核表达载体pCMV-HA-GST-SKA3；(3)真核表达载体pCMV-HA-GST-SKA3的验证将阳性单克隆载体pCMV-HA-GST-SKA3质粒送测序，检测GST-SKA3融合片段的序列情况，验证与PGEX-4T-1-SKA3载体的GST-SKA3序列信息一致；(三)喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中真核表达及纯化(1)接种测序正确的pCMV-HA-GST-SKA3菌液到LB液体培养基扩大培养；(2)提取pCMV-HA-GST-SKA3质粒，使用转染试剂进行载体pCMV-HA-GST-SKA3质粒转...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红亮，吴勇延，高伟，王斌全，张宇良，牛敏，薛绪亭，郑希望，
申请(专利权)人：山西医科大学第一医院，高伟，吴勇延，
类型：发明
国别省市：山西,14