矮牵牛基因PhLcyB及其应用制造技术

本发明专利技术提供矮牵牛基因PhLcyB及其应用。本发明专利技术首次成功克隆了PhLcyB基因全长序列，并通过VIGS技术验证了PhLcyB基因具有调控植物(如矮牵牛)叶片中类胡萝卜素合成的生物学功能。实验表明，PhLcyB基因沉默的植株叶片出现大面积白化现象，花瓣没有明显变化。对白化叶进行片生化检测发现PhLcyB基因沉默后叶片中类胡萝卜素含量明显降低，可知PhLcyB基因对矮牵牛叶片中类胡萝卜素代谢的调节有重要作用。本发明专利技术的PhLcyB基因可用于植物新品种的培育，有利于提高植物叶片中类胡萝卜素的含量。

PhLcyB Gene of Petunia and Its Application

The present invention provides Petunia gene PhLcyB and its application. The full-length sequence of PhLcyB gene was cloned successfully for the first time, and the biological function of PhLcyB gene in regulating carotenoid synthesis in plant leaves (such as Petunia hybrida) was verified by VIGS technology. Experiments showed that the leaves of plants silenced by PhLcyB gene showed large-area albinism, and the petals did not change significantly. Biochemical analysis of albino leaves showed that the carotenoid content in leaves decreased significantly after the silencing of PhLcyB gene. It was concluded that PhLcyB gene played an important role in the regulation of carotenoid metabolism in Petunia leaves. The PhLcyB gene of the invention can be used for cultivating new plant varieties, and is beneficial to improving the content of carotenoids in plant leaves.

【技术实现步骤摘要】
矮牵牛基因PhLcyB及其应用
本专利技术涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体地说，涉及矮牵牛基因PhLcyB及其应用。
技术介绍
矮牵牛(PetuniaHybrida)为多年生草本，常作一二年生栽培，花单生，呈漏斗状，重瓣花球形，是茄科，碧冬茄属植物。原产南美阿根廷，现已在世界各地广泛流传。经过欧美、日本等国的园艺家的不断育种改良，现在矮牵牛的栽培品种已经上百种。在1995年，邵莉等将矮牵牛CHS基因通过农杆菌介导的方式转入植物体，矮牵牛出现花色白化的现象，并且影响植物正常的繁殖能力。研究者自此发现矮牵牛的生长周期短和再生体系的成熟等条件适用于研究花色遗传和转录后基因沉默。自1995～2018年，化占勇、杨伟苑、Richard等许多研究者都使用矮牵牛作为验证基因功能的试验材料。如2016年，杨伟苑等用矮牵牛验证纤维素合成酶催化亚基(Cellulosesynthasecatalyticsubunits,CESAs)基因的功能，经研究发现，被侵染后的植株在表型上出现植株变矮，茎、花梗和花丝等直径变粗，柱头和种子等出现畸形的一些现象。从而验证PhCESA3基因在植物生长发育及抗性方面具有重要地位。病毒诱导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)，是指携带植物目的基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导内源基因的mRNA发生特异性降解，使该基因发生转录水平后的基因沉默，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与传统遗传转化的方法相比，VIGS技术是一种免去大规模筛选突变体，能够在当代完成目的基因验证，有操作简单、适用于植物基因功能分析，成为了功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一。VIGS技术被广泛用于植物的生长发育、抗病虫、代谢调控等相关基因的功能研究中。VIGS技术也被应用于不同类型的植物，如烟草、拟南芥、矮牵牛、番茄、大豆、小麦、草莓等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供矮牵牛基因PhLcyB及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术采用矮牵牛为实验材料，成功克隆了PhLcyB基因全长序列，并通过VIGS技术验证了PhLcyB基因的功能。第一方面，本专利技术提供矮牵牛基因PhLcyB，其特征在于，其为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。第二方面，本专利技术提供含有所述基因PhLcyB的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。第三方面，本专利技术提供所述基因PhLcyB或含有所述基因PhLcyB的生物材料在调控植物叶片中类胡萝卜素合成中的应用，其中，所述植物包括但不限于矮牵牛。具体地，所述调控是指提高植物叶片中类胡萝卜素的含量。本专利技术中，类胡萝卜素包括胡萝卜素和叶黄素。第四方面，本专利技术提供所述基因PhLcyB或含有所述基因PhLcyB的生物材料在制备转基因植物中的应用。第五方面，本专利技术提供所述基因PhLcyB或含有所述基因PhLcyB的生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的包括调控植物叶片中类胡萝卜素的合成，其中，所述植物包括但不限于矮牵牛。第六方面，本专利技术提供所一种提高植物叶片中类胡萝卜素含量的方法，所述方法包括：1)使植物包含所述基因PhLcyB；或2)使植物过表达所述基因PhLcyB。其中，所述植物包括但不限于矮牵牛。进一步地，所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。过表达基因PhLcyB的方法可选自以下1)～4)，或任选的组合：1)通过向植物中导入具有所述基因PhLcyB的质粒；2)通过增加植物染色体上所述基因PhLcyB的拷贝数；3)通过将强启动子与所述基因PhLcyB可操作地连接；4)通过导入增强子。本专利技术中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术首次成功克隆了PhLcyB基因全长序列，并通过VIGS技术验证了PhLcyB基因具有的调控植物(如矮牵牛)叶片中类胡萝卜素合成的生物学功能。实验表明，PhLcyB基因沉默的植株叶片出现大面积白化现象，花瓣没有明显变化。对白化叶进行片生化检测发现PhLcyB基因沉默后叶片中类胡萝卜素含量明显降低，可知PhLcyB基因对矮牵牛叶片中类胡萝卜素代谢的调节有重要作用。本专利技术的PhLcyB基因可用于植物新品种的培育，有利于提高植物叶片中类胡萝卜素的含量。附图说明图1为本专利技术较佳实施例中矮牵牛基因PhLcyB扩增产物的琼脂糖电泳检测结果。图2为本专利技术较佳实施例中重组载体pTRV2-PhLcyB和pTRV2-PhCHS的结构示意图。图3为本专利技术较佳实施例中携带PhCHS、PhLcyB基因片段的重组载体验证结果。图4为本专利技术较佳实施例中通过VIGS技术侵染的矮牵牛植株的表型对比。图5为本专利技术较佳实施例中矮牵牛叶片中类胡萝卜素总含量、胡萝卜素和叶黄素的相对含量/mg·g-1·FW。图6为本专利技术较佳实施例中矮牵牛转基因植株中TRV-PhLcyB基因半定量分析结果。图7为本专利技术较佳实施例中矮牵牛转基因植株中TRV-PhLcyB基因荧光定量表达分析结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例矮牵牛基因PhLcyB的克隆及功能分析1材料与方法1.1植物材料本专利技术以矮牵牛‘旭日’为材料。在植物生长室内播种种植矮牵牛‘旭日’，待长到4片新叶时，作为VIGS功能验证的实验材料。1.1.1矮牵牛总RNA提取及反转录用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒提取植物样品的总RNA，矮牵牛总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明总RNA较完整，可用于后续实验。用北京全式金公司的TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix试剂盒对RNA进行反转录得到cDNA模板。1.2矮牵牛PhLcyB基因的克隆和测定根据矮牵牛‘旭日’转录组测序结果中LCYB基因的Uni本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.矮牵牛基因PhLcyB，其特征在于，其为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.矮牵牛基因PhLcyB，其特征在于，其为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述基因PhLcyB的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。3.权利要求1所述基因PhLcyB或权利要求2所述生物材料在调控植物叶片中类胡萝卜素合成中的应用，其中，所述植物包括矮牵牛。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控是指提高植物叶片中类胡萝...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔金腾，刘悦秋，张克中，梁晶，丁榕，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11