粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种霉粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用，旨在解决化学防治污染、生防菌筛选复杂、生产工艺复杂的技术问题。筛选一株粉红粘帚霉菌（Clonostachys rosea）NF‑06，其保藏编号为CGMCC No.16262。培养制备一种由粉红粘帚霉菌株NF‑06固体发酵而得的固体发酵菌剂。将所述粉红粘帚霉菌株NF‑06或所述固体发酵菌剂在防治植物根结线虫病中应用。本发明专利技术的方法简单易行、成本低，孢子粉有效活菌数高，对生态安全友好，能够较少化学药剂的使用，生产工艺简单，成本低，有利于应用和推广。

Brucella pink, its solid fermentation agent and its application

The invention discloses a mildew-pink viscosa, a solid fermentation agent thereof and its application, aiming at solving the technical problems of chemical pollution prevention, complicated screening of biocontrol bacteria and complex production process. A strain of Clonostachys rosea NF_06 was screened and its preservation number was CGMCC No. 16262. A solid-state fermentation agent was prepared by solid-state fermentation of Brucella Pinkis strain NF_06. The strain NF_06 or the solid fermentation agent of the pink broomstick fungus are applied in the control of plant root knot nematode disease. The method of the invention has the advantages of simple operation, low cost, high effective viable count of spore powder, friendly ecological safety, less use of chemical agents, simple production process and low cost, and is conducive to application and popularization.

【技术实现步骤摘要】
粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用
本专利技术涉及农业生物防治
，具体涉及一种粉红粘帚霉、其固体发酵菌剂及其应用。
技术介绍
病虫害是影响农产品产量和品质的重要因素，其中根结线虫对作物生长的危害逐渐严重。根结线虫主要侵染植物根系，使根系产生根结或结瘿，重病株根系萎缩畸形，吸收营养物质功能受损，导致植株发育不良、早衰等症状，同时根结线虫的侵入在根部留下伤口，导致枯萎病、根腐病等真菌病害的发生。根结线虫病害发生后，一般减产10%～20%，严重的可达75%以上，已成为农业生产中的一大障碍。防治根结线虫可通过农业防治、物理防治、抗病育种、化学防治和生物防治。目前对根结线虫的防治主要以化学防治为主，由于化学杀线剂的毒性强、残留高、破坏土壤生物区系，对人类和环境造成了严重的危害。随着科学技术的发展，对生存环境的追求，农业资源的持续利用、野生生物的物种多样性及环境保护，生物防治是从生态角度研究的新方向。根结线虫生防菌的研究主要在筛选对植物根结线虫具有防治作用的菌株，然而，生防菌筛选过程复杂，工作量大；生长缓慢，生产工艺复杂，成本高，大大限制了生防菌的应用和推广。因此，亟需研发探索新的对根结线虫具有生物活性的新生防资源，以促进农业无害生产和可持续发展。
技术实现思路
本专利技术提供了一株新的粉红粘帚霉NF-06，制备了由粉红粘帚霉菌株NF-06固体发酵而得的固体发酵菌剂，并将粉红粘帚霉菌株NF-06或固体发酵菌剂在防治植物根结线虫病中应用。以解决化学防治污染、生防菌筛选复杂、生产工艺复杂的技术问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：筛选培养出一株粉红粘帚霉菌株NF-06，其分类命名为Clonostachysrosea，于2018年9月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCCNo.16262。利用上述粉红粘帚霉菌株NF-06经固体发酵可制得可用于生物防治的固体发酵菌剂。所述固体发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将所述粉红粘帚霉NF-06接种到固体培养基中，25℃活化培养4～6d；（2）将活化的菌接种至种子液培养基中，在25℃，180r/min条件下，培养45～50h，得种子液；（3）将种子液按照重量百分比为3～10%的比例接种到发酵固体培养基中，在黑暗中于25℃培养12～15d；（4）取固体发酵培养物在35～45℃下干燥至含水量为8%～10%，粉碎，过40～60目筛子，即得。优选的，在步骤（1）中，所述固体培养基为PDA培养基；优选的，在步骤（2）中，所述种子液培养基为PD培养基。优选的，在步骤（3）中，所述发酵固体培养基的配方为：以重量百分比计，玉米粉30%、淀粉20%、蚕豆粉5%、虾粉10%、麦麸15%，秸秆20%。进一步的，所述秸秆的制备方法为：选成熟小麦脱粒后剩余的茎叶，粉碎至长1.5～2.5mm，宽1～2mm，即得。优选的，在步骤（3）中，所述发酵固体培养基的初始含水量控制为30～60%，pH控制为6.0～7.5。优选的，所得粉红粘帚霉固体发酵菌剂的有效活孢子数为7～9×1010个/克。将所述粉红粘帚霉菌株NF-06或所述固体发酵菌剂在防治植物根结线虫病中应用。优选的，施用方法为穴施，施用剂量为1～5g/株。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术筛选到一株新的抗根结线虫的粉红粘帚霉菌株NF-06，于2018年9月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCCNo.16262。2.本专利技术的粉红粘帚霉菌株NF-06与其他粉红粘帚霉菌株相比，具有优越的特点，其产孢量更大，生长更快，能够快速定殖于土壤并发挥生防作用，而且对根结线虫具有独特的双重作用机制（既对二龄线虫具有强烈的致死作用，还对根结线虫具有强烈的寄生作用），鉴于其优越性和独特性，粉红粘帚霉NF-06菌株是一株非常有开发利用潜力的根结线虫生防菌。3.本专利技术中固体发酵菌剂的制备方法简单易行、成本低，孢子粉有效活菌数高达8.73×1010个/克。4.本专利技术的固体发酵菌剂对生态安全友好，能够避免或大大减少化学药剂的使用。5.本专利技术优选了粉红粘帚霉菌株NF-06固体发酵菌剂的制备条件，生产工艺简单，成本低，有利于应用和推广。附图说明图1为菌株NF-06形态学特征中菌株正面照片；图2为菌株NF-06形态学特征中菌株背面照片；图3为菌株NF-06形态学特征中分生孢子梗与分生孢子的显微镜照片；图4为菌株NF-06与菌株FF-128对根结线虫的寄生作用对比图；图5为不同基础培养基的最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；图6为添加不同碳源NF-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；图7为添加不同氮源NF-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；图8为NF-06菌株发酵条件优化正交试验培养基对比统计柱状图；其中，图中培养基1～9对应表3中处理1～9；图9为不同初始含水量培养基NF-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；图10为不同接种量NF-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图；图11为不同pH培养基NF-06菌株最大产孢量及平均产孢量统计柱状图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的分离或检测方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：鉴定粉红粘帚霉专利技术人从根结线虫上分离得到一株微生物菌株，命名为NF-06，其鉴定结果如下：（1）形态学鉴定菌株NF-06的正面如图1所示，背面如图2所示，分生孢子梗与分生孢子如图3所示。从图中可知：菌株NF-06在PDA培养基上菌落边缘整齐，菌丝匍匐，较疏松，初期为白色，后期变为淡粉红色，菌落底有橙红色色素产生。菌株NF-06菌丝有隔膜，分生孢子梗直接从菌丝生出，无色，顶端呈帚状分支，分生末端着生小梗，小梗呈安托瓶状，分生孢子着生于小梗顶端，长椭圆形，大小为2.0~3.5um×5.5～6.5um，经形态学鉴定为粘帚霉属（Clonostachyssp.）的一种。（2）分子生物学鉴定提取菌株DNA，测定菌株NF-06的rDNA-ITS序列，与NCBI数据库进行BLAST比对分析，相似性最高的属种为粉红粘帚霉（Clonostachysrosea）（序列号KT921200），序列相似度达到99%。从NCBI数据库下载其近缘序列构建系统发育树，结果显示菌株NF-06与粉红粘帚霉的亲缘关系最近，结合形态学鉴定，将菌株NF-06鉴定为粉红粘帚霉（Clonostachysrosea）。实施例2：检测NF-06菌株对根结线虫二龄幼虫的寄生作用和致死作用FF-128菌株为专利技术人（张洁）在2017年3月从河南省开封市祥符区罗王乡温室大棚的番茄根系土壤中分离而来的一株粉红粘帚霉，经室内测定发现其对番茄灰霉病、西瓜枯萎病等均具有较强的抑制效果。本试验以粉红粘帚霉FF-128菌株作为对照，分别测定菌株NF-06和菌株FF-128对南方根结线虫二龄幼虫的致死作用和寄生作用。具体步骤如下：将菌株NF-06和菌株FF-128的菌饼（9mm）接种至水琼脂培养基中，25℃培养3天后在菌落四本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株粉红粘帚霉菌株NF‑06，其分类命名为

【技术特征摘要】
1.一株粉红粘帚霉菌株NF-06，其分类命名为Clonostachysrosea，其保藏编号为CGMCCNo.16262。2.一种权利要求1所述粉红粘帚霉菌株NF-06的固体发酵菌剂，其特征在于，由权利要求1所述粉红粘帚霉菌株NF-06固体发酵制得。3.一种权利要求2所述固体发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）先将所述粉红粘帚霉NF-06接种到固体培养基中，25℃活化培养4～6d；（2）再将活化的菌接种至种子液培养基中，在25℃，180r/min条件下，培养45～50h，得种子液；（3）然后将种子液按照重量百分比为3～10%的比例接种到发酵固体培养基中，在黑暗中于25℃培养12～15d；（4）取固体发酵培养物在35～45℃下干燥至含水量为8%～10%，粉碎，过40～60目筛子，即得。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述固体培养基为PDA培养基；在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洁，杨丽荣，郭雪萍，夏明聪，孙润红，汤蒙蒙，武超，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41