一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；所述述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀。本发明专利技术通过微流控技术控制待测样品的流速和流量，具有同一种标志物的肿瘤干细胞通过一条微通道进入检测区，避免相互干扰，从而减少误差，增加反应灵敏度；将待测样品制备成水包水微液滴，增大检测限度。

A Quantitative Detection Card for Tumor Stem Cell Typing and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法
本专利技术涉及微流控技术和免疫荧光微球免疫层析技术相结合的
，具体涉及一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法。
技术介绍
近年来随着生物和医学技术的发展，在肝癌组织、肺癌组织、乳腺癌以及直肠癌等多种恶性肿瘤组织中均可以分离出肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)。肿瘤干细胞是参与调控癌细胞增殖与自我更新，以及维持肿瘤生长的一类在肿瘤组织中含量很少的细胞。肿瘤干细胞和正常组织干细胞在特征上存在诸多的相似性，包括自我更新、多向分化、细胞周期较长等。微流控技术(Microfludics)是指在至少有一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中控制体积为皮升至纳升的流体进行流动并传质、传热的技术。实现微流控操控的主要方法就是将流体限制在一个微米甚至纳米尺度的通道中，流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流、液滴等等。当微通道在微米甚至纳米尺度时，微通道表面积与其内部体积比很大，通道的结构、形状和壁面性质都对流体的流动状态产生极大影响。因此，微流控可以实现一系列常规方法难以完成的微加工和微操作。时间阀的作用就是在固定的时间内控制通过微通道的流体的流速和流量，可以严格控制整个反应的时间并且控制进入检测区的流体量，并且时间阀的孔径尺寸可以设置为循环肿瘤干细胞的尺寸，只能循环肿瘤干细胞通过其他干扰物质无法通过。。荧光微球是指将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。水包水微液滴技术即将富含1.5wt％葡聚糖、0..5wt％海藻糖和0.5wt％明胶加入到不混溶的6.5wt％聚乙二醇的水相中形成原纤维网络，为了增加原纤维网络的吸附作用，加入1wt％鸡蛋清溶菌酶在60℃进行热孵化，原纤维网络转化为成熟的原纤维，再用该成熟的原纤维包裹直径为8μm的的微液滴形成水包水微液滴，使微液滴表面积增加了60％而没有破裂，极大的增加了检测限度，比普通Elisa方法的检测限度增大了1000倍。水包水微液滴具有高度稳定的特异性，避免使用可是蛋白变性的有机溶剂。目前已经明确的肝癌干细胞标志物包括CD133，CD90，CD44，CK19，CK7以及CD133等。CD133蛋白是在人类造血干/祖细胞上发现的一种跨膜糖蛋白，起初被认为是造血干细胞的特异性表面标志物，后来经研究发现该蛋白不仅仅在神经干细胞、表皮干细胞等干细胞中有表达，在各种肿瘤干细胞中也均有表达；CD44蛋白属于在细胞表面广泛表达的糖蛋白，与细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用有关，CamerlingoR等通过流式细胞术筛选出57位乳腺癌病人肿瘤组织细胞中的CD44+细胞，并经鉴别实验证明此类细胞表达有干细胞样特性；CD90是一种葡萄糖6磷酸异构酶锚定的糖蛋白，与CD44一样参与胞间的相互作用。CD90主要表达与肝脏干细胞的表面，然而在成人的肝脏中表达稀少；ALDH1是乙醛脱氢酶(ALDH)家族之一，是催化细胞内的乙醛氧化为乙酸的细胞溶脂酶，是参与乙醇分解的一种重要蛋白。近年来，研究发现ALDH1可能作为肺癌干细胞标志物，并用于白血病干细胞的鉴定与分离。综上所述，循环肿瘤干细胞在肿瘤早期检测中有重要意义。因此，当前迫切需要研发一种高效、低成本的循环肿瘤干细胞检测平台，能够检测血液中循环肿瘤干细胞数量，从而为肿瘤的临床诊断、疗效监控和预后判断提供更准确的信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肿瘤干细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法，其灵敏度高、操作简单、携带方便且制备成本低。使用的荧光微球基本不受外界环境介质变化的影响，稳定性好，染料荧光猝灭大大减少。使用微流控技术设置时间阀的孔径在8μm，使得肿瘤干细胞能够通过时间阀并富集。具体技术方案如下：一种肿瘤干细胞分型定量检测卡，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；所述述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。所述结合区和检测区均为6个，结合区A、B、C、D、E、F分别喷涂有荧光微球A标记的抗CD133抗体、荧光微球B标记的抗CD90抗体、荧光微球C标记的抗CD44抗体、荧光微球D标记的抗CD24抗体、荧光微球E标记的抗pan-CK抗体、荧光微球F标记的抗ALDH1抗体；检测区A、B、C、D、E、F分别包被有抗CD133抗体、抗CD90抗体、抗CD44抗体、抗CD24抗体、抗pan-CK抗体、抗ALDH1抗体。进一步地，荧光微球A的粒径0.51μm、激发波长660nm、发射波长690nm；荧光微球B的粒径0.52μm、激发波长480nm、发射波长520nm；荧光微球C的粒径0.51μm、激发波长360nm、发射波长420nm；荧光微球D的粒径0.87μm、激发波长550nm、发射波长590nm；荧光微球E的粒径0.9μm、激发波长395nm、发射波长410nm；荧光微球F的粒径0.9μm、激发波长460nm、发射波长480nm。所述加样区覆盖圆形滤纸；所述检测区覆盖长方形滤纸条；所述圆形滤纸直径为1.5-2.0cm、孔径为1-3μm；所述长方形滤纸条直径为2cm×7cm。所述微通道通过软光刻技术和微流控芯片技术制备，所述微通道孔径为10-15μm；所述时间阀孔径为8μm。所述的底卡和面卡材质为PMDS；所述底卡和面卡的背面扣合连接。本专利技术还提供了所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)底卡的制备：(1-1)制图；(1-2)掩模；(1-3)光刻；(1-4)再铸模；(1-5)软光刻；(2)在底卡的结合区分别喷涂荧光微球标记的抗体；(3)在底卡的检测区分别包被抗体；(4)将直径1.5-2.0cm、孔径为1-3μm的圆形滤纸覆盖在加样区，直径为2cm×7cm的长方形滤纸条覆盖检测区；(5)将所述底卡和面卡的背面扣合连接。所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)制图：微通道图形按照设计通过绘图软件绘制掩膜版图；(1-2)掩模：制成掩膜版图后，打印在透明胶片上制得光刻掩膜板,利用此掩膜板通过光刻工艺制作硅片模具；(1-3)光刻：在基片表面镀上一层阻挡层，再用甩胶机在阻挡层上均匀地甩上一层光敏材料-光刻胶；在光掩模上制备所需的通道图案；将光掩模复盖在基片上，用紫外光照射涂有光刻胶的基片，光刻胶发生光化学反应；用光刻胶配套显影液通过显影的化学方法除去经曝光的光刻胶；烘干后，利用未曝光的光刻胶的保护作用，采用化学腐蚀的方法在阻挡层上精确腐蚀出底片上平面二维图形，制成所需硅片模具；(1-4)再铸模：通过将弹性材料涂于光刻形成的硅片模具表面，干燥后取下则硅片模具表面上图形转移到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤干细胞分型定量检测卡，包括底卡和面卡，其特征在于，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；所述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤干细胞分型定量检测卡，包括底卡和面卡，其特征在于，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；通过微通道与加样区连接的废液区；所述结合区、检测区、废液区的底部均并联有微通道；结合区及检测区底部并联的微通道均连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。2.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡，其特征在于，所述结合区和检测区均为6个，结合区A、B、C、D、E、F分别喷涂有荧光微球A标记的抗CD133抗体、荧光微球B标记的抗CD90抗体、荧光微球C标记的抗CD44抗体、荧光微球D标记的抗CD24抗体、荧光微球E标记的抗pan-CK抗体、荧光微球F标记的抗ALDH1抗体；检测区A、B、C、D、E、F分别包被有抗CD133抗体、抗CD90抗体、抗CD44抗体、抗CD24抗体、抗pan-CK抗体、抗ALDH1抗体。3.根据权利要求1或2所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡，其特征在于，所述加样区覆盖圆形滤纸；所述检测区覆盖长方形滤纸条；所述圆形滤纸直径为1.5-2.0cm、孔径为1-3μm；所述长方形滤纸条直径为2cm×7cm。4.根据权利要求1或2所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡，其特征在于，所述微通道通过软光刻技术和微流控芯片技术制备，所述微通道孔径为10-15μm；所述时间阀孔径为8μm。5.根据权利要求1或2所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡，其特征在于，所述的底卡和面卡材质为PDMS；所述底卡和面卡的背面扣合连接。6.根据权利要求1-5任意一项所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)底卡的制备：(1-1)制图；(1-2)掩模；(1-3)光刻；(1-4)再铸模；(1-5)软光刻；(2)在底卡的结合区分别喷涂荧光微球标记的抗体；(3)在底卡的检测区分别包被抗体；(4)将直径1.5-2.0cm、孔径为1-3μm的圆形滤纸覆盖在加样区，直径为2cm×7cm的长方形滤纸条覆盖检测区；(5)将所述底卡和面卡的背面扣合连接。7.根据权利要求6所述的肿瘤干细胞分型定量检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)制图：微通道图形按照设计通过绘图软件绘制掩膜版图；(1-2)掩模：制成掩膜版图后，打印在透明胶片上制...

【专利技术属性】
技术研发人员：周辉，
申请(专利权)人：周辉，
类型：发明
国别省市：安徽,34