一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法技术

本发明专利技术涉及生物医用高分子材料制备的技术领域，具体是一种超临界二氧化碳(ScCO2)中固定化脂肪酶活性的测定方法。采用聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性。本发明专利技术方法对于掌握固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性，在超临界二氧化碳中应用固定化酶做催化剂，合成生物医用高分子材料都是非常重要的。本发明专利技术的测定方法原料和溶剂均为绿色试剂，测量方法准确简单，无需大型仪器设备，是一种具有广泛应用前景的固定化酶活性的测试方法。

A Method for the Determination of Immobilized Lipase Activity in Supercritical Carbon Dioxide

The invention relates to the technical field of preparing biomedical polymer materials, in particular to a method for determining the activity of immobilized lipase in supercritical carbon dioxide (ScCO2). The catalytic activity of immobilized porcine pancreatic lipase in supercritical carbon dioxide was determined by acid-base titration using polyvinyl alcohol (PVA) and olive oil as substrates and amino silica as immobilized porcine pancreatic lipase as catalysts. The method of the invention is very important for mastering the catalytic activity of immobilized enzymes in supercritical carbon dioxide, applying immobilized enzymes as catalysts in supercritical carbon dioxide, and synthesizing biomedical polymer materials. The raw material and solvent of the method are green reagents. The method is accurate and simple, and does not need large-scale instruments and equipment. It is a test method for immobilized enzyme activity with wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法
本专利技术涉及生物医用高分子材料制备的
，具体是一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法。技术背景酶催化合成生物可降解脂肪族聚酯是一种新型聚合方法，可以在温和条件下高效合成，有着传统方法难以比拟的优势，但该方法所合成的产物仍存在生物相容性低、机械性能差、分子量低等不足。但是通过酶的固定化、功能化改性、调节支链等方法可以提高酶的催化效率和活性、降低反应能耗和材料中残留的有毒物质、提高原料转化率和产物分子量、增强产物亲水性及开发材料新用途。近年来固载化脂肪酶的技术得到很大的发展，固定化技术使酶稳定性大幅度提高，单位酶的生产力提高，以及重复利用性明显提高。超临界二氧化碳（ScCO2）作为反应介质已经被广泛应用于高分子聚合反应工程，且ScCO2作为反应介质具有有机溶剂无法比拟的优势。本专利技术采用聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在ScCO2中的催化活性。掌握固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性，对于在超临界二氧化碳中应用固定化酶做催化剂，合成生物医用高分子材料是非常重要的，固定化酶在超临界二氧化碳中活性是应用超临界二氧化碳作反应溶剂的基础数据，因此需要一种简便高效的在超临界二氧化碳中测定固定化酶活性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，所述方法采用聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性。上述一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，所述方法包括以下步骤：（1）底物溶液的配置：聚乙烯醇与橄榄油混合，调节底物溶液pH值为6~10，经高速匀质机处理，备用；（2）待测酶液的制备：氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品溶解至PBS溶液中，备用；（3）活性测定过程：将反应釜、底物溶液、酶液分别预热至温度50℃，然后将底物溶液和酶液加入到反应釜中，反应系统用二氧化碳吹扫，关闭出气阀，加热升温至反应温度49~110℃，打压至反应压力8~15MPaMPa，磁力搅拌下保压反应，反应结束后，于釜中加入15mL95%乙醇溶液终止反应，反应液用氢氧化钠标准溶液滴定，至颜色变为粉红，根据消耗氢氧化钠标准溶液的体积计算出固定化脂肪酶活性。可选的，所述步骤（1）中聚乙烯醇的浓度为4%，聚乙烯醇与橄榄油的体积比为3:1，底物溶液pH值为9。可选的，所述步骤（2）中控制酶液浓度，使样品与对照品消耗碱量之差在1~2mL范围内。可选的，所述步骤（2）中氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品0.1~0.2g溶解到20mLPBS溶液中。进一步的，所述步骤（2）中氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品0.2g溶解到20mLPBS溶液中。可选的，所述步骤（3）中橄榄油与氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶的质量比为100:1。可选的，所述步骤（3）中加反应温度为49~110℃，反应压力8~15MPa。进一步的，所述步骤（3）中加反应温度为90℃，反应压力12MPa。酶活性计算说明：式中：X—样品酶的活力，U·g-1；V1—滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；V2—滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；c—氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L），50—1.00mL氢氧化钠溶液(0.05mol/L)相当于脂肪酸50μmol；n1—样品的稀释倍数；0.05—氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；60—反应时间60min。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术以聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性，是一种简便有效的ScCO2中酶活性的测定方法。本专利技术方法测得的数据可用于ScCO2中合成生物医用高分子材料的基础数据，是一种具有广泛应用前景的固定化酶活性的测定方法。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例中所用氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶的制备方法为：（1）制备氨基化二氧化硅颗粒：将正己醇、曲拉通-100和环己烷以1:1:4的体积比混合，再加入水配成乳状液，加入水的量与曲拉通-100的摩尔比为6~20:1，经超声振荡使之均匀，磁力搅拌下加入氨水，15min后加入TEOS，氨水与TEOS的体积比为1:1，0.5h后再加入γ-APTS，TEOS与γ-APTS的体积比为1~4:1，反应在30℃继续进行24h后，反应结束，加入两倍体积的无水乙醇破乳并不断搅拌，则颗粒分离，静置后倒掉清液，沉淀加入无水乙醇洗涤至颗粒完全分离开来，离心弃上清，烘箱40℃干燥至恒重，得到氨基化二氧化硅颗粒；（2）固定化：将氨基化二氧化硅颗粒加入到0.1mol/L、pH=7~9的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，超声使颗粒在溶液中均匀分散，通30min氮气驱除管路和烧瓶内的空气，在氮气保护下，加入戊二醛，戊二醛在上述PBS溶液中的体积浓度为0.5~2.5%，并再通5分钟氮气，25℃下磁力搅拌2h，离心弃去上清液，用0.01mol/LPBS溶液清洗颗粒，去除残余的戊二醛，即得载体溶液，在载体溶液中，加入4mg/mL的猪胰脂肪酶（IPPL）溶液，放置在40℃的恒温摇床中震荡，反应8h，其中IPPL溶液与0.1mol/LPBS溶液的体积比为10:1~4，反应结束后，离心弃去上清液，加入甘氨酸封闭，离心洗涤，用0.01mol/LPBS（含0.001mol/L的EDTA和0.008mol/L的半胱氨酸）清洗颗粒并恒温40℃干燥，得氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶颗粒。实施例1将4%聚乙烯醇(75mL)与橄榄油(25mL)混合，调节pH值为9，用高速匀质机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min），制得底物溶液待用；再将氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品(0.2g)溶解到PBS(20mL)溶液中，制得酶液待用；将反应釜、底物溶液、酶液分别预热至温度50℃，将底物溶液(8mL)和酶液(4.5mL)加入到反应釜中，反应系统用二氧化碳在低压力（6MPa）和小流量（3g/min）下吹扫3分钟，以除去反应釜和管路中的空气，关闭出气阀，加热升温至反应温度90℃，使用柱塞泵打压至反应压力12MPa，磁力搅拌下保压反应1h。反应结束后，拆除反应装置，并于釜中加入15mL95%乙醇溶液终止反应，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至颜色变为粉红，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积，经计算，得到固定化的活性为7.0U/g。实施例2将4%聚乙烯醇(75mL)与橄榄油(25mL)混合，调节pH值为8，用高速匀质机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min），制得底物溶液待用；再将氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品(0.2g)溶解到PBS(20mL)溶液中，制得酶液待用；将反应釜、底物溶液、酶液分别预热至温度50℃，将底物溶液(8mL)和酶液(4.5mL)加入到反应釜中，反应系统用二氧化碳在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，其特征在于，所述方法采用聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性。

【技术特征摘要】
1.一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，其特征在于，所述方法采用聚乙烯醇和橄榄油溶液为底物，氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶为酶催化剂，应用酸碱滴定法测定了固定化酶在超临界二氧化碳中的催化活性。2.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）底物溶液的配置：聚乙烯醇与橄榄油混合，调节底物溶液pH值为6~10，经高速匀质机处理，备用；（2）待测酶液的制备：氨基化二氧化硅固定化猪胰脂肪酶样品溶解至PBS溶液中，备用；（3）活性测定过程：将反应釜、底物溶液、酶液分别预热至温度50℃，然后将底物溶液和酶液加入到反应釜中，反应系统用二氧化碳吹扫，关闭出气阀，加热升温至反应温度40~110℃，打压至反应压力8~15MPa，磁力搅拌下保压反应，反应结束后，于釜中加入15mL95%乙醇溶液终止反应，反应液用氢氧化钠标准溶液滴定，至颜色变为粉红，根据消耗氢氧化钠标准溶液的体积计算出固定化脂肪酶活性。3.根据权利要求2所述的一种超临界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚乙烯醇的浓度为4%，聚乙烯醇与橄...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹世平，王景昌，商雪航，侯维敏，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21