The invention discloses a high-throughput screening method for strains of Saccharomyces cerevisiae based on 48-hole deep-hole plate. Samples of liquor naturally initiated malic acid-lactic acid fermentation in different wine producing areas are collected, separated and purified by ATB medium, and screened by the established 48-hole deep-hole plate lactic acid color reaction system, and then three kinds of multiplication media designed according to the multiplication characteristics of Saccharomyces cerevisiae strains. The screened strains were re-screened by 48-hole deep-hole plate multiplication culture. Finally, the re-screened strains were identified by physiochemical and molecular biology. Compared with the traditional screening method for Saccharomyces cerevisiae, the method is simple and feasible, effectively reduces the intensity of experimental work, and can accurately and rapidly screen Saccharomyces cerevisiae fermented by malic acid and lactic acid in a specific production area within 4 to 6 months, thus realizing high-throughput screening of Saccharomyces cerevisiae.
【技术实现步骤摘要】
一种基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法
本专利技术涉及葡萄酒酿造生产
，特别是一种基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法。
技术介绍
葡萄酒发酵是一系列复杂的微生物代谢和生物转化过程。其中苹果酸-乳酸发酵(malolacticfermentation，MLF)可将葡萄酒中比较尖劣的苹果酸转化为较为柔和圆润的乳酸，达到降低酒品酸度、改善口感和提高酒质、提高酒品微生物稳定性、增加酒品香气复杂性等多重效果，是高品质葡萄酒酿造中非常关键的生产工艺环节之一。MLF能否顺利启动并完成，主要受发酵菌种及其对生境耐受性的影响。研究表明，在能够启动葡萄酒MLF的乳酸菌中，酒酒球菌(Oenococcusoeni，O.oeni)因其较强的葡萄酒生境适应性和优良的发酵特性、良好的产香性能，被认为是启动和完成MLF的优质菌株。目前，法国、美国、葡萄牙等葡萄酒发达国家已经分离筛选出酿酒特性优良的酒酒球菌菌株，并应用于生产实践中，不仅提升了葡萄酒品质，而且充分的体现了产区的风土特色。受生产成本、商业化菌株与酿酒葡萄品种适应性等因素限制，国内绝大多数葡萄酒生产企业在实际生产...
【技术保护点】
1.一种基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)取酒样：用灭菌螺口管从自然启动MLF发酵不同时期的发酵罐取葡萄酒样100mL，根据采集产区和MLF发酵时期对酒样进行分类编号并于‑80℃保存备用；(2)分离纯化：取出备用酒样，混匀后用灭菌生理盐水稀释至10
【技术特征摘要】
1.一种基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)取酒样：用灭菌螺口管从自然启动MLF发酵不同时期的发酵罐取葡萄酒样100mL，根据采集产区和MLF发酵时期对酒样进行分类编号并于-80℃保存备用；(2)分离纯化：取出备用酒样，混匀后用灭菌生理盐水稀释至10-5，选取稀释倍数为103、104、105后，吸取0.1mL涂布接种于ATB分离培养基平板进行分离，28℃生化培养箱中培养5-7d，待菌落形成后挑取菌落形态为边缘整齐、表面光滑、乳白色、湿润、菌落直径小于1mm的单菌落进行反复划线分离直至纯化；(3)菌株初筛：将接种于分离培养基分离纯化后的单菌落，在超净工作台内，用灭菌牙签挑至含有ATB筛选培养基的48孔深孔板中，留6个孔不挑菌作为空白对照，每株菌设置三个重复孔，每个孔板设置三个平行，封盖后置于厌氧培养箱28℃培养3-5d；(4)分离纯化菌株苹果酸转化为乳酸能力检测：从3d开始利用48孔板乳酸显色反应体系检测菌株转化苹果酸的能力，在超净工作台用灭菌牙签将每个孔中的菌液混匀，然后分别用排枪吸取10-50μL菌液至新的高压灭菌的空48孔板中得到培养液，依次加入显色试剂，充分混匀，放入37℃水浴或保温箱中，反应20-60min，观察颜色变化并记录：以不加菌液的空白培养基为对照，用“﹢﹢﹢”表示显色最明显，“﹢﹢”表示显色较明显，“﹢”表示有显色，“﹣”表示颜色无变化，通过检测培养液中的L-乳酸生成量，挑取显色反应为显色最明显“﹢﹢﹢”的为初筛菌株；(5)菌株复筛：将初筛所得菌株经ATB分离培养基划斜面活化后，每株菌挑取3个单菌落分别接种于含有三种增殖培养基的深孔板中，并留有多个孔不接菌，作为对照组，每株菌设置3个重复孔板，将接菌后的多孔板置于厌氧培养箱25-28℃下培养3-5d，待48孔板底部有明显菌体沉淀后，利用48孔板乳酸显色反应体系进行检测，筛选产乳酸能力较优菌株；(6)菌种鉴定：利用理化试验对复筛菌株进行初步鉴定，通过分子生物学方法进行菌种最终鉴定。2.根据权利要求1所述的基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中ATB分离培养基由ATB基础培养基中加入50mg/L放线菌酮组成，所述每升ATB基础培养基中包含以下重量的成分：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，盐酸半胱氨酸0.5g，葡萄糖10g，与TB筛选培养基体积比为25％的番茄汁。3.根据权利要求1所述的基于48孔深孔板的酒酒球菌菌株高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中48孔板中的ATB筛选培养基装液量为1.5-4.0mL，每升ATB筛选培养基中包含以下重量的成分：蛋白胨10...
【专利技术属性】
技术研发人员：祝霞，杨学山，王璐璐，刘琦，黎洁，韩舜愈，赵丹丹，赵芳琴，王诗，海玲，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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