一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法技术

一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL‑60的方法，用人类急性白血病细胞株HL‑60为模型，参附注射液25.50μL/mL,高乌甲素100μL/mL，亚砷酸钠15μmol/L；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。经药物处理60h后HL‑60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL‑60细胞NBT还原能力增强，药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。

A Method for Inducing Leukemia Cell Line HL-60 by Ginseng-aconitine

A method of inducing leukemia cell line HL 60 by Shenfu Gaowu A was developed. The model of human acute leukemia cell line HL 60 was Shenfu injection 25.50 ugL/mL, Gaowu A injection 100 ugL/mL and sodium arsenite 15 umol/L. Cell proliferation, cell morphology, reduction ability of nitrotetrazolium blue (NBT), cell cycle distribution and apoptotic rate were measured. After 60 hours of drug treatment, the morphological changes of HL 60 cells were mainly apoptotic. After 60 hours of low concentration Shenfu injection (12.5 ugL/mL) and Gaowu A injection (50 ugL/mL), the NBT reduction ability of HL 60 cells was enhanced. After 60 hours of drug treatment, 100 ugL/mL Gaowu A solution and 25.50 ugL/mL Shenfu solution flow cytometry showed a sub-diploid apoptotic peak on the histogram. The mortality rate increased in varying degrees.

【技术实现步骤摘要】
一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法
本专利技术涉及一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法，具体地说是以一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法。
技术介绍
目前公知的中医药抗肿瘤研究领域根据《内经》“积之始生，得寒乃生，厥乃成积”、“阳化气，阴成形”的理论，逐步重视温阳法的研究。
技术实现思路
材料与方法1、主要药物参附注射液每毫升相当于生药红参0.1g,附片0.2g，由雅安三九药业有限公司生产（批号：20043116）；氢溴酸高乌甲素注射液（2mg/mL，由广州天心药业股份有限公司生产，批号：040501）；亚砷酸氯化钠注射液由哈尔滨伊达药业有限公司生产（批号：20050302）。以上药物均购自广东省中医院药房，临用时以磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释。2、主要试剂；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均由Sigma公司生产；Wright-Giemsa混合染液由广州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由Clbiochem公司生产；硝基四氮唑蓝（NBT）由Mbchem公司生产；碘化丙啶（PI）染色液由BectonDickinson公司生产。3、主要仪器；Bio-Rad-450型全自动酶标仪为美国Bio-Rad公司产品；150-400型细胞培养箱为英国Biotech公司产品；3169型倒置显微镜为日本Nikon公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台为苏州净化设备厂产品；TGL-16型高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品；NexPower1000型纯水器为韩国HumanCorp产品；FACSCalibur型流式细胞仪为BectonDickinson公司产品；普利生MIAS2000型智能骨髓图像分析系统为北京—深圳普利生公司产品；NikonE200型普通光学显微镜为日本Nikon公司产品。4、细胞模型；HL-60细胞株购自中山大学动物中心细胞库，在广州中医药大学基础医学院生化教研室实验室传代培养。实验时取对数生长期细胞，2g/L台盼蓝拒染实验证实活细胞数大于95%，并调整实验时所需密度。5、实验方法和检测指标；分组；设参附注射液、氢溴酸高乌甲素注射液实验组（简称参附液组、高乌甲素组），在实验的不同阶段，参附液组终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL，高乌甲素组终浓度分别为25、50、100μL/mL，亚砷酸钠对照组则取0.25、2、15μmol/L3个浓度。并设空白（本底）对照组、阴性对照组。细胞加药培养；在实验的不同阶段，按相应的设计要求接种制备好的细胞悬液到12或96孔培养板中（每孔细胞量见具体项目），分别加培养基及药物。96孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基180μL，然后按不同浓度加药，最后不足200μL的孔则用PBS补足至每孔总体积为200μL；12孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基至终体积2.5mL,再按不同浓度加药。然后分别置入37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱培养。每天将接种好的培养板取出置于倒置显微镜下观察1～2次，以及时掌握细胞生长状况。不同药物及浓度对HL-60细胞生长的影响；参附液、高乌甲素各设3个不同的药物浓度组，以细胞终浓度为2×104/mL接种到96孔培养板中，培养48h后采用MTT法检测各组存活率、半数抑制浓度（IC50）。细胞增殖抑制的MTT测定：加药培养后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，在细胞培养箱孵育4h后取出，用1.5mL离心管离心去上清，每管加DMSO150μL，按原顺序放回96孔板轻轻震荡15min,采用酶标仪在570nm波长下测定各孔D值，根据下列公式计算细胞存活率：p细胞存活=（D加药组/D对照组）×100%。不同作用时间对HL-60细胞生长的影响；参考1.5.3的结果，取96孔板接种细胞。高乌甲素组设终浓度为50μL/mL，参附液组设终浓度为50μL/mL，细胞终浓度为2×104/mL，分别在培养24、48、72h取出相应培养板，按上法进行MTT检测。计算各组存活率，绘制生长曲线。细胞形态观察；进行1.5.3、1.5.4指标检测时每天将接种好的培养板取出，置于倒置显微镜下观察细胞生长状况1～2次。12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h后用PBS漂洗2次后，以体积分数为70%的乙醇将细胞固定后收集固定细胞涂片，吹干，Wright-Giemsa混合染液及甲基绿—派诺宁染色，晾干后普通光学显微镜下，观察200个细胞进行分类计数，智能骨髓图像分析系统拍照记录。NBT实验（还原反应比色法）；以每孔3×103个细胞接种到96孔板中培养5d后，1000r/min离心5min收集细胞，再将细胞悬浮于200μL/孔的NBT溶液中（内含0.24μg/mL的TPA），放入培养箱中培养1h，细胞离心去上清液，每孔加入200μLDMSO，室温下震荡20min，在570nm波长下测定D值。流式细胞仪检测细胞周期分布、凋亡率；12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h，用PBS漂洗2次，调整细胞至1×106个/mL，再加体积分数为70%的乙醇（-20℃）固定细胞过夜后，上流式细胞仪以PI单染法检测细胞周期分布、凋亡率。统计学处理采用MicrosoftExcel软件进行统计分析。结果：参附注射液作用后HL-60细胞增殖受抑制，高乌甲素注射液对HL-60的生长无抑制作用；经药物处理60h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL-60细胞NBT还原能力增强，而其他浓度组NBT还原能力反未增强；药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。专利技术目的：乌头碱、人参皂苷类物质抗肿瘤的研究也逐渐开展，在常用的中药中，温阳作用效强力专者首推附子类药物，其中所含乌头碱类物质是其主要效应成分。结合我们临床应用温肾法为主治疗肿瘤经验，从诱导分化、凋亡角度，观察临床常用的温阳法代表针剂——参附注射液及乌头碱类药物高乌甲素（拉巴乌头碱、刺乌头碱）注射液对人类急性白血病细胞株HL-60的作用。技术方案：采用人类急性白血病细胞株HL-60为模型，设参附注射液组（终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL）,高乌甲素组（终浓度分别为25、50、100μL/mL），亚砷酸钠对照组（终浓度分别为0.25、2、15μmol/L）及阴性对照组；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。参附注射液作用后HL-60细胞增殖受抑制，高乌甲素注射液对HL-60的生长无抑制作用；经药物处理60h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL-60细胞NBT还原能力增强，而其他浓度组NBT还原能力反未增强；药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。专利技术有益效果：参附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL‑60的方法，用人类急性白血病细胞株HL‑60为模型，参附注射液25.50μL/mL,高乌甲素100μL/mL，亚砷酸钠15μmol/L；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标；经药物处理60h后HL‑60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL‑60细胞NBT还原能力增强，药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。

【技术特征摘要】
1.一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法，用人类急性白血病细胞株HL-60为模型，参附注射液25.50μL/mL,高乌甲素100μL/mL，亚砷酸钠15μmol/L；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标；经药物处理60h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL-60细胞NBT还原能力增强，药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永红，
申请(专利权)人：王永红，
类型：发明
国别省市：甘肃,62