一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用，属于生物技术领域。选择报告基因的表达框分别由油菜基因组ALS基因启动子和具有双突变位点的抗ALS抑制类除草剂基因—mALS3基因以及ALS基因的终止子序列构成。通过农杆菌介导法遗传转化烟草，在转化过程中直接利用磺酰脲类除草剂绿磺隆做再生株的筛选剂，获得转基因烟草。经过PCR检测和抗除草剂性鉴定，表明通过这一途径获得的转基因烟草具有兼抗苯磺隆、双氟磺酰胺和双草醚等多种ALS抑制剂类除草剂的特性，因此，我们认为由油菜ALS基因启动子、抗除草剂基因、和终止子序列构成的表达框可用做选择报告基因表达框，该载体可以用于双子叶植物的遗传转化。

Construction and Application of a Vector Containing Selective Reporting Gene Expression Frame from Complete Plant Source

The invention relates to a vector construction method and application of a selective reporter gene expression frame containing complete plant origin, belonging to the field of biotechnology. The expression frame of the selected reporter gene is composed of the promoter of ALS gene in rapeseed genome, the anti-ALS inhibitory herbicide gene-mALS3 gene with double mutation sites and the terminator of ALS gene, respectively. Transgenic tobacco was obtained by Agrobacterium-mediated transformation, in which chlorosulfuron, a sulfonylurea herbicide, was directly used as a screening agent for regeneration plants. The results of PCR detection and herbicide resistance identification showed that the transgenic tobacco obtained by this way had the characteristics of resistance to bensulfuron-methyl, difluorosulfonamide and dichloroether and other ALS inhibitors. Therefore, we think that the expression frame composed of ALS gene promoter, herbicide resistance gene and terminator sequence of rape can be used as the selective reporter gene expression frame, and the vector can be used as a selective reporter gene expression frame. For genetic transformation of dicotyledons.

【技术实现步骤摘要】
一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用一、
本专利技术涉及一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法及应用，属于生物
二、
技术介绍
转基因生物技术源于上世纪的重组DNA技术的专利技术，1973年美国科学家专利技术了重组DNA技术，最初转基因技术应用于医药领域，如一些重组疫苗、干扰素等均是转基因产品。进入80年代，转基因技术开始应用于农业育种领域，1983年美国首例转基因植物(烟草和马铃薯)培育成功。自1996年始，转基因作物在全球包括美国、巴西、阿根廷、中国、印度等28个国家商业化应用，至2015年已有26种转基因作物(不包括康乃馨、玫瑰和矮牵牛)的363个转化体获准商业化种植或环境释放，包括以抗除草剂和抗虫为主的玉米、大豆、油菜及棉花等。从1996～2016年，全球转基因作物商业化种植面积从170万公顷增加到1.851亿公顷，增长了110倍，农民收益超过了1500亿美元。但随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增加，转基因植物中选择标记基因的生物安全性已成为人们普遍关注的问题之一。目前在植物遗传转化中广泛应用的标记基因主要有2大类，一类是编码可使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体的构建方法，其特征在于：完全采用甘蓝型油菜基因组来源的抗ALS抑制剂类除草剂基因元件，构建选择报告基因的表达框。

【技术特征摘要】
1.一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体的构建方法，其特征在于：完全采用甘蓝型油菜基因组来源的抗ALS抑制剂类除草剂基因元件，构建选择报告基因的表达框。2.根据权利要求1所述的一种含完全植物来源的选择报告基因表达框的载体构建方法，其特征在于：所述选择报告基因的表达框的启动子、选择报告基因和终止子分别由油菜基因组ALS基因启动子SEQ.ID.NO.1、具有双突变位点的抗ALS抑制类除草剂基因mALS3基因SEQ.ID.NO.2、以及ALS基因的终止子序列SEQ.ID.NO.3构成。3.根据权利要求1或2所述的一种含完全植物来源的选择报告基因的植物表达载体构建方法，其特征在于：1)线性化载体：利用pCAMBIA0390载体序列，设计特异引物0390F(SEQ.ID.NO.4)5-’TGGCGGGATAACCTAAGAGAAAAGAG-3’，0390R(SEQ.ID.NO.5)5’-CGTTAACACTAGTCAGATCTACCATGG-3’，通过PCR扩增线性化载体，在此过程中缺失掉原载体T-DNA区域内的nospolyA序列，胶回收纯化6.4Kb的PCR产物，用于载体重组反应；2)含双突变位点的抗除草剂基因mALS3的克隆：以申请号为201710166233.2的发明专利“基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用”获得的油菜抗除草剂基因peasy-mALS3为模板，设计特异性扩增引物，并在上游引物的5’末端增加了同源重组序列，即下化线部分表示增加的碱基序列，以下同，与启动子序列3’末端同源,引物对序列分别为ALSF(SEQ.ID.NO.6)5’-CTCTCTCCTCTAACCATGGCGGCGGCAACATCGTCTTCTC-3’和ALSR(SEQ.ID.NO.7)5'-TCAGTACTTAGTGCGACCATCC-3'；应用北京全式金生物技术有限公司出品的高保真DNA聚合酶试剂盒扩增mALS3基因序列；胶回收纯化1.9Kb的PCR产物，用于载体重组反应；3)油菜ALS基因启动子序列克隆:以专利申请号：201710701957.2的发明专利“甘蓝型油菜ALS基因启动子及应用”获得的油菜ALS基因启动子序列为模板设计特异性引物，并在上游引物的5’末端引入与线性化载体左侧末端同源的碱基序列，引物分别为：PrF(SEQ.ID.NO.8)5’-TGACTAGTGTTAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松，彭琦，浦惠明，张洁夫，胡茂龙，付三雄，高建芹，龙卫华，陈锋，王晓东，张维，周晓婴，熊冬琴，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32