一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法技术

本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。该方法以植物乳杆菌基因组为模板，设计特异性引物扩增亚硝酸盐还原酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆至表达载体pKLAC2构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得亚硝酸盐还原酶表达产物。本发明专利技术制备得到的重组亚硝酸盐还原酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，为亚硝酸盐还原酶的工业化生产奠定了基础，可用于食品、医药等领域。

Eukaryotic expression of nitrite reductase gene in Lactobacillus plantarum

The invention discloses an eukaryotic expression method of nitrite reductase gene in Lactobacillus plantarum. The method used Lactobacillus plantarum genome as template, designed specific primers to amplify nitrite reductase gene sequence, introduced restriction sites at both ends, and subcloned them to expression vector pKLAC2 to construct recombinant plasmid. The recombinant plasmid was electrotransformed into Kluyveromyces lactis after restriction linearization, and positive clone transformants were screened. Finally, the fermentation broth was obtained through seed culture and liquid fermentation culture. The supernatant is the product of nitrite reductase expression. The recombinant nitrite reductase prepared by the invention has high enzyme activity and stable enzyme activity, which lays a foundation for industrialized production of nitrite reductase and can be used in food, medicine and other fields.

【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法
本专利技术涉及亚硝酸盐还原酶基因的真核表达，属于分子生物学
，具体涉及一种植物乳杆菌来源的亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法及表达产物的应用。
技术介绍
亚硝酸盐是自然界氮循环中的重要物质，广泛存在于土壤、水和植物中，是一种潜在的致癌物质，在人们日常生活中极易积累，过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，孕妇过量摄入亚硝酸盐可导致胎儿畸形。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。在水产养殖中，亚硝酸盐会使鱼体内氧气减少从而影响鱼类的生理活动致其死亡。此外，含氮化合物还是大气中细颗粒物(PM2.5)成分之一，而PM2.5的大小对人类的身心健康有很大影响。因此，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行。目前运用物理、化学方法降解亚硝酸盐仍具有成本高、见效慢、降解不彻底和二次污染等缺点。目前，生物降解能有效控制并降解亚硝酸盐，亚硝酸盐还原酶是生物降解过程中的关键酶。亚硝酸盐还原酶(nitritereductase，简称为NiR)是一种脱氮反应中的关键酶，它脱氮过程有两种：(1)在能催化亚硝酸盐(NO2-)失去电子生成一氧化氮(NO)；(2)催化亚硝酸盐(NO2-)进行氨合并生成铵根离子(NH4+)。NiR根据结构类型可以分为细胞色素cd1型和铜型，其编码基因分别为nirS和nirK。菌株皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstoniapickettii)、蜡状芽孢杆菌、胃幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、乳酸菌和豌豆、玉米和玉米叶中均发现了NiRs。但野生菌中亚硝酸盐还原酶具有蛋白含量少，杂蛋白多，提取困难等缺点。目前，有大量报道利用基因工程技术得到大量NiR。在亚硝酸盐还原酶基因的克隆和表达的研究中，人们首先在大肠杆菌中表达了亚硝酸盐还原酶的基因。但在大肠杆菌中重组的亚硝酸盐还原酶大多以包涵体的形式存在于细胞内，它需要复杂的加工过程才能恢复蛋白质的活性，为了提高其产量还需加入IPTG等诱导剂。所以研究者仍在寻找有效表达的宿主。作为单细胞微生物，酵母既具有细菌系统一样易于操作和生长的特点，又可以像真菌那样对重组蛋白进行译后加工和修饰。酵母用于重组蛋白的表达具有诸多优势。酵母能以较高的水平表达重组蛋白，同时可以将重组蛋白分泌到培养基中。而在酵母表达系统中乳酸克鲁维酵母具有许多优于其它酵母表达系统诸多优点。实验证明乳酸克鲁维酵母具有卓越的外源蛋白的分泌能力。乳酸克鲁维酵母具有FDA认证的GRAS地位，允许在多种食品和饲料中应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)来源的亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，实验结果显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。本专利技术的技术方案是：一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，该方法是以植物乳杆菌基因组为模板，设计特异性引物扩增亚硝酸盐还原酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆至表达载体pKLAC2构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得亚硝酸盐还原酶表达产物。具体步骤如下：(1)植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆以植物乳杆菌基因组为模板，以序列5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(EcoRI)为上游引物，5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)为下游引物，通过PCR特异性扩增亚硝酸盐还原酶基因，回收PCR产物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1；(2)重组表达载体的构建将表达载体pKLAC2和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI和XhoI双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆菌株；(3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经SacII线性化后电转化Kluyveromyceslactis，于3～5天后挑取单菌落验证，从而得到阳性克隆转化子；(4)重组酶在Kluyveromyceslactis中的表达将步骤(3)筛选到的阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2～3％的接种量种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养14～18h，取发酵液上清，即得亚硝酸盐还原酶表达产物。其中所述的YPD培养基配方为：1g酵母粉，2g蛋白胨，2g葡萄糖，100mL蒸馏水。本专利技术还提供了上述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到亚硝酸盐还原酶表达产物在食品及医药领域的应用。本专利技术以经工业分离的非营养缺陷型菌株的乳酸克鲁维酵母为宿主，以携带有真菌乙酰胺酶基因可以富集含有多个拷贝表达框的转化子的pKLAC2为载体，克隆亚硝酸盐还原酶的基础上，构建亚硝酸盐还原酶分泌型表达载体，在乳酸克鲁维酵母中进行初步的分泌表达，及其酶学性质的研究。本专利技术的有益技术效果是：本专利技术以植物乳杆菌基因组为模板，通过重组pKLAC2-nir的构建，转化，阳性克隆转化子的筛选，液体发酵等步骤，在中Kluyveromyceslactis成功表达了植物乳杆菌来源的亚硝酸盐还原酶。实验结果表明，本专利技术制备得到的重组亚硝酸盐还原酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，为亚硝酸盐还原酶的工业化生产奠定了基础，可用于食品、医药等领域。附图说明图1为实施例1中利用Lactobacillusplantarum基因组DNA为模板进行PCR扩增产物鉴定图，其中M为DNA分子量；1～5为PCR扩增产物。图2为实施例2中构建的重组质粒进行双酶切鉴定图，其中M为DNA分子量；1为pKLAC2-nir被EcoRI、XhoI产物；2为质粒pKLAC2-nir。图3为实施例4中含有重组质粒pKLAC2-nir的Kluyveromyceslactis后的电泳检测结果，其中，M表示蛋白质marker；1为pKLAC2；2为pKLAC2-nir。图4为实施例5中纯化后的NiR的蛋白质的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质marker；1-3为Ni2+柱的80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L咪唑溶液洗脱液。图5为实施例6中酶学性质测定，pH对酶活性的影响变化趋势图，其中a为重组NiR的最适pH，b为酶的pH稳定性。图6为实施例6中酶学性质测定，温度对酶活性的影响变化趋势图，其中a为重组NiR的最适温度，b为酶的热稳定性。具体实施方式以下结合附图，并通过实施例对本专利技术进行具体说明。实施例1植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的制备，包括如下步骤：1、PCR引物设计以Genbank中可以查到的植物乳杆菌的DNA设计出PCR引物：上游引物(SEQIDNO.2)为5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(EcoRI)，下游引物(SEQIDNO.3)为5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)，并人工合成这对上下游引物；2、植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的提取(细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TakaraMinibestBacteri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆以植物乳杆菌基因组为模板，以序列5‑CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA‑3(EcoRI)为上游引物，5‑CTTAAGAATCCTGTTTGGAC‑3(XhoI)为下游引物，通过PCR特异性扩增亚硝酸盐还原酶基因，回收PCR产物，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；(2)重组表达载体的构建将表达载体pKLAC2和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI和XhoI双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆菌株；(3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经SacII线性化后电转化Kluyveromyces lactis，于3～5天后挑取单菌落验证，从而得到阳性克隆转化子；(4)重组酶在Kluyveromyces lactis中的表达将步骤(3)筛选到的阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2～3％的接种量种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养14～18h，取发酵液上清，即得亚硝酸盐还原酶表达产物；其中所述的YPD培养基配方为：1g酵母粉，2g蛋白胨，2g葡萄糖，100mL蒸馏水。...

【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆以植物乳杆菌基因组为模板，以序列5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(EcoRI)为上游引物，5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)为下游引物，通过PCR特异性扩增亚硝酸盐还原酶基因，回收PCR产物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1；(2)重组表达载体的构建将表达载体pKLAC2和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI和XhoI双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coliDH5α，筛选阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，李美玉，迟乃玉，王晓辉，于爽，胡善松，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21