一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法技术

本发明专利技术提供一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，通过PDL1/PDL2超增强子的切除、抑制调控细胞表面PDL1、PDL2的表达。所述PDL1/PDL2超增强子为PDL1基因和PDL2基因之间的一段DNA序列：hg19_dna range＝chr9:5498729‑5502895，序列长度7709bp。本发明专利技术通过检测PDL1/PDL2超增强子的DNA数量、活化状态、DNA的序列差异来预测肿瘤的发病风险，进展的风险及免疫检测点抑制剂的治疗效果。

A control method based on PDL1/PDL2 superenhancer to regulate the expression of PDL1 and PDL2

The invention provides a method for controlling the expression of PDL1 and PDL2 based on PDL1/PDL2 superenhancer, and inhibits the expression of PDL1 and PDL2 on the cell surface by excising PDL1/PDL2 superenhancer. The PDL1/PDL2 superenhancer is a DNA sequence between PDL1 gene and PDL2 gene: hg19_dna range=chr9:5498729_5502895, with a length of 7709bp. The invention predicts the risk of cancer, the risk of progression and the therapeutic effect of immunoassay point inhibitors by detecting the DNA quantity, activation state and DNA sequence difference of PDL1/PDL2 superenhancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法
本专利技术属于医疗研究领域，具体涉及一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法。
技术介绍
肿瘤细胞为了能够生长，必须逃逸免疫系统的监视，为了实现这个过程，肿瘤细胞表面表达多种能够逃过免疫细胞识别或是抑制免疫细胞功能的分子。PDL1和PDL2是PD-1的配体，PD-L1和PD-L2通过和免疫细胞主要是T细胞表面的PD-1结合，来抑制T细胞的功能，导致免疫系统无法有效清除肿瘤细胞。为了实现肿瘤细胞表面PDL1和PDL2的高表达，肿瘤细胞发展了多种途径，如蛋白稳定、RNA稳定等。具体上，肿瘤细胞如何实现PDL1、PDL2或PDL1和PDL2同时高表达的机制还没有完全理解清楚。由于肿瘤的发生、发展和PDL1及PDL2的表达程度密切相关，因此通过检测PDL1、PDL2的表达情况，可以预测人群发生和发展成肿瘤的概率。另外，通过抑制PD1、PDL1和PDL2的功能，可以增强免疫系统的功能，实现清除肿瘤细胞的目的，这也是现在临床治疗肿瘤最有效和热门的方法，即免疫检测点抑制剂(PD-1受体及其配体PD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，其特征在于，通过PDL1/PDL2超增强子的切除、抑制调控细胞表面PDL1、PDL2的表达。

【技术特征摘要】
1.一种基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，其特征在于，通过PDL1/PDL2超增强子的切除、抑制调控细胞表面PDL1、PDL2的表达。2.根据权利要求1所述的基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，其特征在于，所述PDL1/PDL2超增强子为PDL1基因和PDL2基因之间的一段DNA序列：hg19_dnarange＝chr9:5498729-5502895，序列长度7709bp。3.根据权利要求1所述的基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，其特征在于，所述PDL1/PDL2超增强子的切除采用基因编辑技术。4.根据权利要求1～3中任一项所述的基于PDL1/PDL2超增强子的调控PDL1和PDL2表达的控方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)PDL1/PDL2超增强子使细胞表面PDL1和PDL2高表达的验证在基因水平上，通过实时定量PCR技术检测HBL、SU-DHL-2、SUM159、RaJi、SU-DHL-10、B-16、U266细胞内PDL1及PDL2的拷贝数，发现SUM159细胞较其他细胞系高表达PDL1及PDL2；(1-1)实时定量PCR步骤：(1-1-1)提取RNA：1、收集HBL、SU-DHL-2、SUM159、RaJi、SU-DHL-10、B-16、U266细胞；2、各加1mlTrizol裂解细胞；3、各加0.2ml氯仿，4℃下12000rpm离心15分钟分离两相；4、提取水相层，加入等体积异丙醇，4℃下12000rpm离心15分钟沉淀RNA；5、加入1ml的75％乙醇，清洗沉淀的RNA，4℃下7000rpm离心5分钟；6、干燥后加入DEPC水溶解RNA；(1-1-2)逆转录：使用逆转录试剂盒RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(Thermo)，体系如下：(1-1-3)实时定量PCR实验：(2)PDL1/PDL2超增强子的切除过程在DNA序列：hg19_dnarange＝chr9:5498729-5502895的上下游分别设计两个sgRNA：sgRNA-1、sgRNA-2，构建了两个新的的Crispr/Cas9质粒；(2-1)构建sgRNA-CRISPR质粒(2-1-1)1、酶切载体2、琼脂糖凝胶电泳；3、切胶回收；(2-1-2)sgRNA引物退火(2-1-3)连接(2-2)构建稳转细胞系(2-2-1)种板：转染前一天在六孔板里种SUM159细胞，细胞密度保持在30％-50％左右；(2-2-2)转染：1、1ugsgRNA-1和1ugsgRNA-2CRISPR/Cas9质粒同时加入50ulOpti-mem无血清转染培养基中，同样地，1ugsgV...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛仁芳，徐元培，吴英成，吴凡，范义辉，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32