一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体设计一种提高草莓叶片再生效率的载体及其应用。从森林草莓中筛选得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段，构建得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300‑FveHK2，进而转染转基因工程菌，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK2基因的RNAi表达干扰株系，在离体叶片组织培养条件下，FveHK2基因抑制表达系的出芽时间早于野生型，出芽率显著高于野生型，表明遗传转化FveHK2干扰载体的森林草莓转基因株系叶片的再生能力显著提高。本发明专利技术对草莓叶片再生及转化效率的提高具有重要意义。

A Carrier for Improving the Regeneration Efficiency of Forest Strawberry Leaves and Its Preparation Method and Application

The invention belongs to the field of plant genetic engineering technology, and specifically designs a carrier for improving the regeneration efficiency of strawberry leaves and its application. The RNA interference fragment of FveHK2 was screened from forest strawberry, and the plant inhibitory expression vector GN2300 FveHK2 was constructed. The vector was then transfected into the diploid forest strawberry `Hawaii 4'. The RNA interference strain of FveHK2 gene was obtained and cultured in vitro. The germination time of FveHK2 inhibited expression line was earlier than that of wild type, and the germination rate was significantly higher than that of wild type, which indicated that the leaf regeneration ability of forest strawberry transgenic lines with FveHK2 interference vector was significantly improved. The invention has important significance for Strawberry Leaf Regeneration and improvement of transformation efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用。
技术介绍
草莓(Fragaria×ananazsaDuch.)属于蔷薇科草莓属，多年生草本植物。果实甜美可口，营养价值高，且具有保健功效。近年来，各地生产中急需大批优良草莓苗，但采用常规苗木繁殖，繁殖系数较低、成本较高，现多采用组培技术繁殖草莓苗。最早进行草莓离体培养研究是在20世纪60年代，日本的下村等研究表明，用热处理和生长点培养相结合的方法排除草莓病毒病效果较好。1963年，Miller首次报道了利用茎尖培养可成功获得草莓组培植株，Rosati等用凤梨草莓等4个品种的花药进行离体培养成功获得植株。1989年，Nehra最早建立了“Redcoat”草莓品种的高频叶盘再生系统，之后陆续有一些草莓品种如红颊、章姬、丰香等叶片再生体系的研究报道。另一方面，伴随草莓产业的快速发展，生产上对其优质种苗的需求量增加，不同草莓品种的需求亦是不断增加。然而，草莓生产面临着不断变化的病、虫害危害和高、低温等环境胁迫；传统的育种方法很难培育出优良的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段在提高森林草莓叶片再生效率中的应用，所述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2包括FveHK2a和FveHK2b两个同源基因，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列为位于NCBI登录号为XM_004293409的FveHK2b序列733～1032bp区域的序列；(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少有93％同一性且位于NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列834bp～1133bp区域的序列。

【技术特征摘要】
1.森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段在提高森林草莓叶片再生效率中的应用，所述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2包括FveHK2a和FveHK2b两个同源基因，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：(1)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列为位于NCBI登录号为XM_004293409的FveHK2b序列733～1032bp区域的序列；(2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列至少有93％同一性且位于NCBI登录号为XM_011462025的FveHK2a序列834bp～1133bp区域的序列。2.一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，其特征在于，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中，插入由权利要求1所述的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列构成的ihpRNA发夹结构所得到。3.根据权利要求2所述的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2，其特征在于，所述植物抑制表达载体GN2300-FveHK2中ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的植物抑制表达载体GN2300-FveHK2的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：获得森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段：根据NCBI数据库登录号：XM_004293409公布的FveHK-2b序列为模板，设计特异性引物FveHK2-RNAi-F1：5'-TCAATGTCAGCAAGAACCAG-3'(SEQIDNo.4)和FveHK2-RNAi-R1：5'-CAGGATGCTTGACCTATCAT-3'(SEQIDNo.5)，扩增得到SEQIDNO.1所示的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的正向序列；设计特异性引物FveHK2-RNAi-F2：5'-ATACTGTAGACTGCGGAACT-3'(SEQIDNo.6)和FveHK2-RNAi-R2：5'-CTGGTTCTTGCTGACATTGA-3'(SEQIDNo.7)，扩增得到SEQIDNO.1所示森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK2的RNA干扰片段的反向序列；S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁静，马琳琳，王永，李春，李义，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32