一种荧光检测脂肪酶活性的方法技术

本发明专利技术属于生物质化学和可再生资源利用领域，具体涉及一种荧光检测脂肪酶活性的方法。本发明专利技术将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1；将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合，30～40℃水浴反应10～30min，去除脂肪酶，得到混合溶液3；将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性。本发明专利技术与现有技术相比，更加灵敏、检测下限更加低，可实现微量级的检测，应用更加广泛。

A Fluorescence Detection Method for Lipase Activity

The invention belongs to the field of biomass chemistry and renewable resource utilization, in particular to a method for fluorescence detection of lipase activity. The invention mixes non-ionic surfactant solution and curcumin solution, then adds soluble copper salt solution to obtain mixed solution 1; mixes methyl mercaptoacetate solution and phosphate buffer solution to obtain mixed solution 2; mixes mixed solution 2 with lipase sample to be measured, and reacts in water bath at 30-40 degrees C for 10-30 minutes, removes lipase, and obtains mixed solution 3; Liquor 1 and mixed solution 3 were mixed and reacted at 20-40 for 3-10 min. The activity of lipase in lipase solution was quantitatively determined by external standard method with fluorescence intensity. Compared with the prior art, the invention is more sensitive, has lower detection limit, can realize micro-level detection, and has wider application.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光检测脂肪酶活性的方法
本专利技术属于生物质化学和可再生资源利用领域，具体涉及一种荧光检测脂肪酶活性的方法。
技术介绍
脂肪酶[E.C.3.1.1.3]是重要的工业用酶，能特异性识别羧酸酯中的酯键，并催化水解切割酯键生成脂肪酸和醇，在食品、化妆品、制药以及生物柴油等领域常作为催化剂使用。脂肪酶在生物化工中的大量应用，使脂肪酶活性的检测研究成为基础有机应用研究领域的重要课题。与其它水解酶类(如乙酰胆碱酯酶和碱性磷酸酶)不同，脂肪酶只在油-水界面上才能被活化，是一种界面反应酶，脂肪酶的催化属于异相催化(Heterogeneous-catalyzed)，且不溶于水的脂肪酶底物需要被乳化，乳化剂的加入常会导致分析体系复杂化，产生信号干扰，并对测量的真实性产生重大影响。因此脂肪酶活性的检测与其它水解酶相比更为复杂。传统脂肪酶活性的检测方法，如pH滴定法、浊度法，操作繁琐，耗时较长，灵敏度低。因此，开发高灵敏度、高通量检测脂肪酶活性的分析方法具有重要的实际应用价值。姜黄素是一种从姜黄根茎中分离出来的天然的二酮类化合物，作为抗癌药物，近年来在细胞培养和医学研究方面得到了较多的应用。姜黄素具有可见光吸收和荧光光谱特性，吸收峰位于410～430nm范围内，荧光发射位于460～560nm范围内。近年来，许多研究者利用姜黄素的光谱特性构建生物传感器，但姜黄素水溶性差，在水溶液中稳定性也差，限制了其实际应用。研究表明，姜黄素中的β-二酮结构可与金属离子结合，姜黄素的特征吸收峰位置基本保持不变，但强度发生变化。大豆多糖、磷脂脂质体以及非离子型表面活性剂吐温40和TritonX-100均能作为包封姜黄素的载体，显著提高其溶解性和吸收以及荧光性质。本课题组近年来致力于脂肪酶活性的比色和荧光检测基于姜黄素的特性，汤燕等通过制备吐温40-姜黄素复合物胶束，成功组装了脂肪酶活性检测的荧光法传感器。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的目的在于提供一种荧光检测脂肪酶活性的方法，该方法具有成本低廉、操作简单、灵敏度高的特点，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种荧光检测脂肪酶活性的方法，包含如下步骤：(1)将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2；(2)将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；(3)将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合；30～40℃水浴反应10～30min，过滤去除脂肪酶，得到混合溶液3；(4)将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性；步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂为吐温40和TritonX-100中的至少一种；步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂优选为吐温40；步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度优选为100～500μmol/L；步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度进一步优选为300μmol/L；步骤(1)中所述的混合溶液1中可溶性铜盐的浓度优选为0.4～0.6μmol/L；步骤(1)中所述的混合溶液1中可溶性铜盐的浓度进一步优选为0.5μmol/L；步骤(2)中所述的混合溶液2的pH优选为6～8；步骤(2)中所述的混合溶液2的pH进一步优选为7；步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.2mmol/L，pH优选为7.0；步骤(2)中所述的巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液的体积比优选为3:1；步骤(3)中混合溶液2和待测脂肪酶样品混合后巯基乙酸甲酯的浓度优选为0.75～1.875mmol/L；步骤(3)中混合溶液2和待测脂肪酶样品混合后巯基乙酸甲酯的浓度进一步优选为1.125mmol/L；步骤(3)中所述的水浴反应的条件优选为35℃水浴反应15min；步骤(4)中所述的混合溶液1和混合溶液3的体积比优选为20:1；步骤(4)中所述的反应的条件优选为25℃反应5min；本专利技术的原理：本研究以吐温40-姜黄素复合物胶束为荧光信号探针，Cu2+为猝灭剂，巯基乙酸甲酯作为脂肪酶的底物，构建了检测脂肪酶活性的生物传感器。在Cu2+的作用下，吐温40-姜黄素复合物胶束的荧光几乎被完全猝灭；脂肪酶可催化水解巯基乙酸甲酯生成巯基乙酸，巯基乙酸能夺取姜黄素-Cu2+复合物上的Cu2+从而使吐温40-姜黄素复合物胶束的荧光恢复，荧光强度恢复的程度与脂肪酶的活性有关。与传统的检测脂肪酶方法相比，本方法具有成本低廉、操作简单、灵敏度高的特点，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)与现有技术相比，本专利技术以吐温40-姜黄素复合物胶束为荧光信号探针，Cu2+为猝灭剂，巯基乙酸甲酯作为脂肪酶的底物，进行脂肪酶活性检测，相较于传统方法更加灵敏、检测下限更加低，可实现微量级的检测，应用更加广泛。(2)本专利技术在信号源等方面进行了优化和探索，最终建立了一套基于荧光信号的检测系统，该系统的建立对于脂肪酶具有非常好的检测效果，可实现对脂肪酶活性的高通量检测。(3)本专利技术成本低廉、操作简单，适用范围广，不论来源于什么物种只要是脂肪酶都可以应用该检测方法。附图说明图1是不同体系的荧光光谱图；其中，(a)吐温40+姜黄素；(b)吐温40+姜黄素+Cu2+；(c)吐温40+姜黄素+Cu2++巯基乙酸甲酯+脂肪酶；(d)吐温40+姜黄素+Cu2++巯基乙酸甲酯+失活脂肪酶；(e)吐温40+姜黄素+Cu2++巯基乙酸甲酯。右上角内插照片为与光谱曲线相对应的荧光照片。图2是不同体系的紫外-可见吸收光谱图；其中，(a)吐温40+姜黄素；(b)吐温40+姜黄素+Cu2+；(c)吐温40+姜黄素+Cu2++巯基乙酸甲酯+脂肪酶；(d)吐温40+姜黄素+Cu2++巯基乙酸甲酯，右上角内插照片为与光谱曲线相对应的荧光照片。图3是不同反应参数对姜黄素-吐温40体系荧光的影响的结果分析图；其中，A：Cu2+浓度对姜黄素-吐温40体系荧光的影响；B：不同浓度的巯基乙酸甲酯对姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光的影响；C：pH值对姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光的影响；D：不同酶水解温度对姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光的影响。图4是不同活性的Novozymes435脂肪酶的酶促反应动力学曲线图。图5是不同活性的脂肪酶对姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光光谱和荧光信号差值结果分析图；其中，A：不同活性的脂肪酶对姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光光谱的影响；B：脂肪酶活性与姜黄素-吐温40-Cu2+体系荧光信号差值的关系曲线，插图为线性关系曲线。图6是姜黄素-Cu2+复合物体系荧光检测脂肪酶选择性的结果分析图。图7是实际样品检测结果分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中涉及的主要仪器与试剂如下所示：SpectraMaxM3微孔板检测系统(美国分子仪器公司)；电子天平(德国赛多利斯公司)；PHS-3CpH计(上海雷磁公司)；吐温40、姜黄素、无水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、NaOH等均为分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光检测脂肪酶活性的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2；(2)将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；(3)将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合；30～40℃水浴反应10～30min，过滤去除脂肪酶，得到混合溶液3；(4)将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；然后进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种荧光检测脂肪酶活性的方法，其特征在于包含如下步骤：(1)将非离子型表面活性剂溶液和姜黄素溶液混合，然后加入可溶性铜盐溶液，得到混合溶液1，其中，姜黄素和可溶性铜盐的摩尔比为1:2；(2)将巯基乙酸甲酯溶液和磷酸盐缓冲溶液混合，得到混合溶液2；(3)将混合溶液2和待测脂肪酶样品混合；30～40℃水浴反应10～30min，过滤去除脂肪酶，得到混合溶液3；(4)将混合溶液1和混合溶液3混合，20～40℃反应3～10min；然后进行荧光检测，然后采用外标法以荧光强度定量待测脂肪酶溶液脂肪酶活性。2.根据权利要求1所述的荧光检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的非离子型表面活性剂为吐温40和TritonX-100中的至少一种。3.根据权利要求1所述的荧光检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的混合溶液1中非离子型表面活性剂的浓度为100～500μmol/L。4.根据权利要求1所述的荧光检测脂肪酶活性的方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：马艳玲，陈甜妹，曾荣，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44