抗原偶联的杂交试剂制造技术

本公开提供用于各种杂交测定和其他相关技术的高效杂交试剂。杂交试剂包含寡核苷酸探针和桥接抗原，其中桥接抗原被可检测的抗体以高亲和力识别。本公开还提供了包含特异于多种不同靶核酸的杂交试剂组的组合物和包含杂交试剂对及其互补的可检测的抗体的组合物。成对的杂交试剂和可检测的抗体可用于各种杂交测定，特别是在高度多重测定中，其中桥接抗原的结构随着可检测的抗体的变化而相应变化，从而提供了多重杂交试剂，其能够在单次测定中同时检测多重靶核酸。本公开还提供了包含杂交试剂的试剂盒，使用本公开的杂交试剂的杂交测定方法和杂交试剂的制备方法。

Antigen-Coupled Hybrid Reagents

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗原偶联的杂交试剂相关申请的交叉引用本申请要求于2016年7月18日提交的美国临时申请No.62/363,825的权益，其全部的公开内容通过引用并入本文。
技术介绍
在具有高灵敏度和特异性的细胞测定中，在低于皮克水平的一些情况下检测低表达靶标标志物(包括蛋白质和核酸)的能力仍然是未满足的需求。随着可用于分析的细胞和组织的样品尺寸变得越来越小，这种方法变得更加重要。此外，在单次测定中同时检测多种低表达靶标的能力将是进一步的益处。原位杂交(ISH)是用于检测生物样品中的核酸的强大的标记技术。一般方法通常涉及使用与固定组织或细胞样品中的目的靶核酸互补的标记的DNA、RNA或修饰的核酸探针。标记的探针与样品中的靶标DNA或RNA序列杂交，从而提供关于一个或多个遗传基因座(例如，用于基因组DNA靶标)或一个或多个表达基因(例如，用于RNA靶标)的时间和空间信息。可以根据用于修饰探针的标记的类型以及因此用于鉴定靶标的检测方法将原位杂交技术彼此区分。对于显色原位杂交(CISH)测定，使用过氧化物酶或碱性磷酸酶反应(如IHC染色中常规使用的反应和标记)在靶标位置处产生显色信号。随后使用明视场显微镜观察信号。CISH可用于测定(例如)基因扩增、基因缺失、染色体易位和染色体数目。CISH尤其适用于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织、中期染色体分散、固定细胞和血液或骨髓涂片。对于荧光原位杂交(FISH)测定，荧光标记用于检测过程，并且使用荧光显微术或相关光谱技术检测信号。使用具有光谱上不同的荧光特性的多个荧光标记使得能够在单个样品内同时检测和共定位多个核酸靶标。因此，对于DNA靶标，FISH可用于(例如)检测目的基因组基因座的存在、拷贝数和位置，并鉴定基因突变体和染色体缺陷。对于RNA靶标，FISH可用于(例如)在时间和空间上评估基因表达，从而提供对生理过程和疾病发病机理的见解。原位杂交技术可另外与免疫组织化学(IHC)染色技术组合使用，以同时标记在组织样品中或在另一合适表面上的靶核酸和表达靶标蛋白。然而，尽管上述方法是有用的，但是仍然需要开发改进的杂交测定试剂、方法和试剂盒，其在单次测定中更灵敏、更具特异性、能够检测更多种核酸靶标。
技术实现思路
本公开通过在一个方面中提供了在各种杂交测定中发现有用的杂交试剂组合物来解决了这些和其他需要。具体而言，根据本专利技术的该方面，所述杂交试剂组合物包含：与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针；和可检测的抗体；其中所述可检测的抗体对所述桥接抗原具有高亲和力特异性。在一些实施方案中，桥接抗原是肽或小分子半抗原。在一些实施方案中，桥接抗原包含多个抗原决定簇。在具体实施方案中，多个抗原决定簇中的每个抗原决定簇是相同的。在其他具体实施方案中，多个抗原决定簇包含线性重复结构。更具体而言，线性重复结构是线性重复肽结构。在其他具体实施方案中，多个抗原决定簇包括至少三个抗原决定簇，或者桥接抗原包括支化结构。在一些实施方案中，桥接抗原是包含非天然残基的肽。具体而言，非天然残基可以是非天然立体异构体或β-氨基酸。在一些实施方案中，利用化学偶联反应通过缀合部分将寡核苷酸探针和桥接抗原偶联。在具体实施方案中，通过高效缀合部分偶联寡核苷酸探针和桥接抗原。在这些实施方案的一些中，高效缀合部分是席夫碱，例如腙或肟。在一些实施方案中，通过点击反应形成高效缀合部分。在一些实施方案中，缀合部分包含可切割的接头。在实施方案中，可检测的抗体包含可检测的标记。在一些实施方案中，可检测的标记是荧光团、酶、上转换纳米颗粒、量子点或可检测的半抗原。在具体实施方案中，可检测的标记是荧光团。在其他具体实施方案中，酶是过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶；碱性磷酸酶；或是葡萄糖氧化酶。根据一些实施方案，可检测的抗体对于桥接抗原是特异性的，解离常数为至多100nM、至多30nM、至多10nM、至多3nM、至多1nM、至多0.3nM、至多0.1nM、至多0.03nM、至多0.01nM、至多0.003nM，甚至更低。一些组合物实施方案包含多个桥接抗原偶联的寡核苷酸探针和多个可检测的抗体，包括含有三个、五个、十个甚至更多个试剂对的组合物。在另一方面，本公开提供了免疫试剂，包含：与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针。在具体实施方案中，杂交试剂包括上述杂交试剂组合物的杂交试剂的一个或多个特征。根据另一方面，本公开提供了包含多个任意上述杂交试剂的多重杂交试剂组合物。在具体实施方案中，所述组合物包含至少三种、至少五种、至少十种、甚至更多种杂交试剂。在另一方面，本公开提供了用于杂交测定的方法，包括：提供包含第一靶核酸的第一样品；使所述第一靶核酸与第一杂交试剂反应，其中所述第一杂交试剂是与所述第一靶核酸互补的任何上述杂交试剂；使所述第一杂交试剂与第一可检测的抗体反应，其中所述第一可检测的抗体对所述第一杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及检测与所述第一杂交试剂的桥接抗原相关的第一可检测的抗体。在具体实施方案中，第一可检测的抗体包含可检测的标记。更具体地，可检测的标记可以是荧光团、酶、上转换纳米颗粒、量子点或可检测的半抗原。在一些实施方案中，可检测的标记是荧光团，并且在一些实施方案中，酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。在具体实施方案中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶。在一些实施方案中，第一靶核酸在组织切片内。在这些实施方案中，检测步骤可以是荧光检测步骤或酶检测步骤。在一些实施方案中，第一靶核酸可以在细胞中或细胞上。在这些实施方案中，第一靶核酸可以在细胞的细胞质中或细胞核中。在一些实施方案中，检测步骤是荧光检测步骤，并且在具体实施方案中，该方法还可以包括分选结合第一可检测的抗体的细胞的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括：使所述第一样品上的第二靶核酸与第二杂交试剂反应，其中所述第二杂交试剂是与所述第二靶核酸互补的任何上述杂交试剂；使所述第二杂交试剂与第二可检测的抗体反应，其中所述第二可检测抗体对所述第二杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及检测与所述第二杂交试剂的桥接抗原相关的所述第二可检测的抗体。更具体的方法实施方案还包括检测样品中的至少三种靶核酸、样品中的至少五种靶核酸、或甚至是样品中的至少十种靶核酸。一些方法实施方案还包括以下步骤：使第二样品上的第二靶核酸与第二杂交试剂反应，其中所述第二杂交试剂是与所述第二靶核酸互补的任何上述杂交试剂；使所述第二杂交试剂与第二可检测的抗体反应，其中所述第二可检测的抗体对所述第二杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及检测与所述第二杂交试剂的桥接抗原相关的所述第二可检测的抗体；其中所述第一样品和所述第二样品是组织样品的连续切片。其他方法实施方案包括以下步骤：提供包含第一靶核酸的样品；使所述第一靶核酸与第一杂交试剂反应，其中所述第一杂交试剂是与所述第一靶核酸互补的任何上述杂交试剂；使所述第一杂交试剂与第一反应性抗体反应，其中所述第一反应性抗体以高亲和力结合所述第一杂交试剂的桥接抗原；以及使所述第一反应性抗体与第一可检测的试剂反应，其中所述第一可检测的试剂与所述第一靶核酸附近的样品结合。在一些实施方案中，这些方法还包括以下步骤：从样品中解离出第一反应性抗体。在一些实施方案中，这些方法还包括以下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交试剂组合物，包含：与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针；和可检测的抗体；其中所述可检测的抗体对所述桥接抗原具有高亲和力特异性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.18 US 62/363,8251.一种杂交试剂组合物，包含：与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针；和可检测的抗体；其中所述可检测的抗体对所述桥接抗原具有高亲和力特异性。2.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原是肽。3.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原包含多个抗原决定簇。4.根据权利要求3所述的杂交试剂组合物，其中所述多个抗原决定簇中的每个抗原决定簇是相同的。5.根据权利要求3所述的杂交试剂组合物，其中所述多个抗原决定簇包含线性重复结构。6.根据权利要求5所述的杂交试剂组合物，其中所述线性重复结构是线性重复肽结构。7.根据权利要求3所述的杂交试剂组合物，其中所述多个抗原决定簇包含至少三个抗原决定簇。8.根据权利要求3所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原包含支化结构。9.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原是包含非天然残基的肽。10.根据权利要求9所述的杂交试剂组合物，其中所述非天然残基是非天然立体异构体。11.根据权利要求9所述的杂交试剂组合物，其中所述非天然残基是β-氨基酸。12.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述寡核苷酸探针和所述桥接抗原利用化学偶联反应通过缀合部分偶联。13.根据权利要求12所述的杂交试剂组合物，其中所述寡核苷酸探针和所述桥接抗原通过高效缀合部分偶联。14.根据权利要求13所述的杂交试剂组合物，其中所述高效缀合部分是席夫碱。15.根据权利要求14所述的杂交试剂组合物，其中所述席夫碱是腙或肟。16.根据权利要求13所述的杂交试剂组合物，其中所述高效缀合部分通过点击反应形成。17.根据权利要求12所述的杂交试剂组合物，其中所述缀合部分包含可切割的接头。18.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述寡核苷酸探针与编码细胞标志物的基因或由所述基因表达的RNA的至少一个片段互补。19.根据权利要求18所述的杂交试剂组合物，其中所述细胞标志物选自由以下物质构成的组中：4-1BB、AFP、ALK1、淀粉样蛋白A、淀粉样蛋白P、雄激素受体、膜联蛋白A1、ASMA、BCA225、BCL-1、BCL-2、BCL-6、BerEP4、β-连环蛋白、β-HCG、BG-8、BOB-1、CA19-9、CA125、降血钙素、钙调蛋白结合蛋白、钙结合蛋白-1、钙视网膜蛋白、CAM5.2、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD38、CD42b、CD43、CD45LCA、CD45RO、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、CD99、CD117、CD138、CD163、CDX2、CEA、嗜铬粒蛋白A、CMV、c-kit、c-MET、c-MYC、IV型胶原、补体3c(C3c)、COX-2、CXCR5、CK1、CK5、CK6、CK7、CK8、CK14、CK18、CK17、CK19、CK20、CK903、CKAE1、CKAE1/AE3、D2-40、结蛋白、DOG-1、E-钙粘着蛋白、EGFR、EMA、ER、ERCC1、因子VIII-RA、因子XIIIa、Fascin、FoxP1、FoxP3、凝集素-3、GATA-3、GCDFP-15、GCET1、GFAP、血型糖蛋白A、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒酶B、HBME-1、幽门螺杆菌、血红蛋白A、HepPar1、HER2、HHV-8、HMB-45、HSVl/ll、ICOS、IFNγ、IgA、IgD、IgG、IgM、IL17、IL4、抑制素、iNOS、κIg轻链、Ki67、LAG-3、λIg轻链、溶菌酶、乳糖珠蛋白A、MART-1/MelanA、肥大细胞胰蛋白酶、MLH1、MOC-31、MPO、MSA、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUM1、MyoD1、肌细胞生成素、肌红蛋白、天冬氨酸蛋白A、巢蛋白、NSE、Oct-2、OX40、OX40L、p16、p21、p27、p40、p53、p63、p504s、PAX-5、PAX-8、PD-1、PD-L1、PHH3、PIN-4、PLAP、PMS2、卡氏肺孢子虫、PR、PSA、PSAP、RCC、S-100、SMA、SMM、平滑肌特异性蛋白、SOX10、SOX11、表面活性剂载脂蛋白A、突触素蛋白、TAG72、TdT、血栓调节蛋白、甲状腺球蛋白、TIA-1、TIM3、TRAcP、TTF-1、酪氨酸酶、尿溶蛋白、VEGFR-2、绒毛蛋白、波形蛋白和WT-1。20.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述可检测的抗体包含可检测的标记。21.根据权利要求20所述的杂交试剂组合物，其中所述可检测的标记是荧光团、酶、上转换纳米颗粒、量子点或可检测的半抗原。22.根据权利要求21所述的杂交试剂组合物，其中所述可检测的标记是荧光团。23.根据权利要求21所述的杂交试剂组合物，其中所述酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。24.根据权利要求23所述的杂交试剂组合物，其中所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶。25.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原包含可检测的标记。26.根据权利要求25所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原的可检测的标记是荧光团。27.根据权利要求25所述的杂交试剂组合物，其中所述可检测的抗体包含可检测的标记。28.根据权利要求27所述的杂交试剂组合物，其中所述桥接抗原的可检测的标记和所述二抗的可检测的标记都可以通过相同波长的荧光检测。29.根据权利要求1所述的杂交试剂组合物，其中所述可检测的抗体对于所述桥接抗原具有特异性，其解离常数为至多100nM、至多30nM、至多10nM、至多3nM、至多1nM、至多0.3nM、至多0.1nM、至多0.03nM、至多0.01nM、或至多0.003nM。30.一种多重杂交试剂组合物，其包含多种根据权利要求1至29中任一项所述的杂交试剂组合物。31.根据权利要求30所述的多重杂交试剂组合物，其中所述组合物包含至少三种杂交试剂组合物。32.根据权利要求30所述的多重杂交试剂组合物，其中所述组合物包含至少五种杂交试剂组合物。33.根据权利要求30所述的多重杂交试剂组合物，其中所述组合物包含至少十种杂交试剂组合物。34.一种杂交试剂，包含：与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针。35.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述桥接抗原是肽。36.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述桥接抗原包含多个抗原决定簇。37.根据权利要求36所述的杂交试剂，其中所述多个抗原决定簇中的每个抗原决定簇是相同的。38.根据权利要求36所述的杂交试剂，其中所述多个抗原决定簇包含线性重复结构。39.根据权利要求38所述的杂交试剂，其中所述线性重复结构是线性重复肽结构。40.根据权利要求36所述的杂交试剂，其中所述多个抗原决定簇包含至少三个抗原决定簇。41.根据权利要求36所述的杂交试剂，其中所述桥接抗原包含支化结构。42.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述桥接抗原是包含非天然残基的肽。43.根据权利要求42所述的杂交试剂，其中所述非天然残基是非天然立体异构体。44.根据权利要求42所述的杂交试剂，其中所述非天然残基是β-氨基酸。45.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述寡核苷酸探针和所述桥接抗原利用化学偶联反应通过缀合部分偶联。46.根据权利要求45所述的杂交试剂，其中所述寡核苷酸探针和所述桥接抗原通过高效缀合部分偶联。47.根据权利要求46所述的杂交试剂，其中所述高效缀合部分是席夫碱。48.根据权利要求47所述的杂交试剂，其中所述席夫碱是腙或肟。49.根据权利要求46所述的杂交试剂，其中所述高效缀合部分通过点击反应形成。50.根据权利要求45所述的杂交试剂，其中所述缀合部分包含可切割的接头。51.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述寡核苷酸探针与编码细胞标志物的基因或由所述基因表达的RNA的至少一个片段互补。52.根据权利要求51所述的杂交试剂，其中所述细胞标志物选自由以下物质构成的组中：4-1BB、AFP、ALK1、淀粉样蛋白A、淀粉样蛋白P、雄激素受体、膜联蛋白A1、ASMA、BCA225、BCL-1、BCL-2、BCL-6、BerEP4、β-连环蛋白、β-HCG、BG-8、BOB-1、CA19-9、CA125、降血钙素、钙调蛋白结合蛋白、钙结合蛋白-1、钙视网膜蛋白、CAM5.2、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD38、CD42b、CD43、CD45LCA、CD45RO、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、CD99、CD117、CD138、CD163、CDX2、CEA、嗜铬粒蛋白A、CMV、c-kit、c-MET、c-MYC、IV型胶原、补体3c(C3c)、COX-2、CXCR5、CK1、CK5、CK6、CK7、CK8、CK14、CK18、CK17、CK19、CK20、CK903、CKAE1、CKAE1/AE3、D2-40、结蛋白、DOG-1、E-钙粘着蛋白、EGFR、EMA、ER、ERCC1、因子VIII-RA、因子XIIIa、Fascin、FoxP1、FoxP3、凝集素-3、GATA-3、GCDFP-15、GCET1、GFAP、血型糖蛋白A、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒酶B、HBME-1、幽门螺杆菌、血红蛋白A、HepPar1、HER2、HHV-8、HMB-45、HSVl/ll、ICOS、IFNγ、IgA、IgD、IgG、IgM、IL17、IL4、抑制素、iNOS、κIg轻链、Ki67、LAG-3、λIg轻链、溶菌酶、乳糖珠蛋白A、MART-1/MelanA、肥大细胞胰蛋白酶、MLH1、MOC-31、MPO、MSA、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUM1、MyoD1、肌细胞生成素、肌红蛋白、天冬氨酸蛋白A、巢蛋白、NSE、Oct-2、OX40、OX40L、p16、p21、p27、p40、p53、p63、p504s、PAX-5、PAX-8、PD-1、PD-L1、PHH3、PIN-4、PLAP、PMS2、卡氏肺孢子虫、PR、PSA、PSAP、RCC、S-100、SMA、SMM、平滑肌特异性蛋白、SOX10、SOX11、表面活性剂载脂蛋白A、突触素蛋白、TAG72、TdT、血栓调节蛋白、甲状腺球蛋白、TIA-1、TIM3、TRAcP、TTF-1、酪氨酸酶、尿溶蛋白、VEGFR-2、绒毛蛋白、波形蛋白和WT-1。53.根据权利要求34所述的杂交试剂，其中所述桥接抗原包含可检测的标记。54.根据权利要求53所述的杂交试剂，其中所述可检测的标记是荧光团。55.一种多重杂交试剂组合物，包含多种根据权利要求34至54中任一项所述的杂交试剂。56.根据权利要求55所述的多重杂交试剂组合物，其包含至少三种杂交试剂。57.根据权利要求55所述的多重杂交试剂组合物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·A·施瓦茨，
申请(专利权)人：赛尔伊迪克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US