枯草杆菌酶变体和对其进行编码的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及适用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物的枯草杆菌酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体、表达载体、宿主细胞的分离的DNA序列，和用于产生和使用本发明专利技术变体的方法。这些变体表现出改进的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】枯草杆菌酶变体和对其进行编码的多核苷酸序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术介绍

本专利技术涉及适用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物的枯草杆菌酶变体。本专利技术还涉及编码这些变体、表达载体、宿主细胞的分离的DNA序列，和用于产生和使用本专利技术变体的方法。相关领域说明在洗涤剂工业中，酶已经在洗涤配制品中实施了几十年。此类配制品中使用的酶包含淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露糖苷酶和蛋白酶，以及其他酶或其混合物。商业上，最重要的酶是蛋白酶。越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体Liquanase和(诺维信公司(NovozymesA/S))、Purafect和(杰能科国际公司(GenencorInternationalInc.))。另外，本领域描述了许多蛋白酶变体，如WO91/00345(诺维信公司)和WO94/23053(诺维信公司)描述了例如在位置262处的突变。这些变体适用于例如清洁或洗涤剂组合物。已经描述了许多有用的枯草杆菌酶变体，其中许多变体提供了在不同的洗涤剂中的改进的活性、稳定性和溶解性。然而，各种因素使得蛋白酶的进一步改进是有利的。洗涤条件(如温度和pH)随时间而变化，并且在常规洗涤条件下许多污渍仍然难以完全去除。另外，洗涤中条件可导致酶的失活(由于例如pH、温度或螯合不稳定性)，从而导致洗涤周期期间洗涤性能的丧失。因此，尽管在蛋白酶开发上进行了密集研究，对相比于亲本蛋白酶具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤中稳定性和/或储存稳定性，以及优选地相似的或改进的洗涤性能的新的且改进的蛋白酶仍存在需求。
技术实现思路
本专利技术涉及具有蛋白酶活性并且包含一组两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，这些取代选自X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置。本专利技术进一步涉及具有蛋白酶活性并且包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]的枯草杆菌酶变体，其中这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置。本专利技术进一步涉及具有蛋白酶活性并且包含一组两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，这些取代选自X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置，其中(a)这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置；(b)该变体具有蛋白酶活性；并且(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：(i)SEQIDNO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和(ii)SEQIDNO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685xln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。本专利技术进一步涉及包含一组取代的枯草杆菌酶变体：X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]，其中(a)这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置；(b)该变体具有蛋白酶活性；并且(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：(i)SEQIDNO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和(ii)SEQIDNO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685xln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。本专利技术进一步涉及包含取代X262E+X209W+X205I的枯草杆菌酶变体，其中(a)这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置；(b)该变体具有蛋白酶活性；(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草杆菌酶变体，其包含一组选自以下的两个或更多个以下取代：X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；(b)该变体具有蛋白酶活性；并且(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；并且(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于‑3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝‑ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)‑Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝‑2685x ln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 EP 16172888.61.一种枯草杆菌酶变体，其包含一组选自以下的两个或更多个以下取代：X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中(a)这些位置对应于SEQIDNO:2的多肽的位置；(b)该变体具有蛋白酶活性；并且(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：(i)SEQIDNO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；并且(ii)SEQIDNO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685xln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。2.如权利要求1所述的变体，其中该变体与选自下组的多肽具有至少70％的序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：(i)SEQIDNO:1，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和(ii)SEQIDNO:2，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]。3.如权利要求1或2所述的变体，其中所述组包含以下取代：X194[P,A]+X204[D,N]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G,S]+X216[V,S]+X259[S,D]+X261[N,W]+X262[E]。4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中所述组包含以下取代：X194[P]+X204[D]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G]+X216[V]+X259[D]+X261[W]+X262[E]。5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO:2的多肽的位置194-216的位置处包含选自下组的序列，该组由以下组成：6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：JE尼尔森，MI乔尔克，LLH克里斯滕森，MB西洛，PK汉森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK