一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术的表达载体能够表达抗体治疗剂，所述抗体治疗剂能够进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，能抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。抗体治疗剂，可用于开发成治疗PRRS的药物。利用酶联免疫实验，证明抗体治疗剂与PRRS病毒Nsp9的互作。将细胞与抗体治疗剂共孵育，利用间接免疫荧光实验证明了抗体治疗剂能够进入细胞。同时利用抗体治疗剂进行病毒抑制试验，证明了抗体治疗剂能够抑制PRRS病毒的复制。

An Antibody, Expression Vector and Therapeutic Agent for Inhibiting PRRS Virus Replication

The invention belongs to the field of genetic engineering technology, and discloses an antibody, expression vector and therapeutic agent for inhibiting PRRS virus replication. The nucleotide sequence of the antibody for inhibiting PRRS virus replication is SEQ ID NO:1. The expression vector of the invention can express an antibody therapeutic agent, which can enter cells and specifically bind to the non-structural protein Nsp9 of PRRS virus, and can inhibit the proliferation of PRRS virus in PAMs cells. Antibody therapeutics can be used to develop drugs for PRRS. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to verify the interaction between antibody therapy and PRRS virus Nsp9. The cells were co-incubated with antibody therapeutics, and indirect immunofluorescence experiments showed that the antibody therapeutics could enter the cells. At the same time, the viral inhibition test was carried out by using antibody therapeutics, which proved that the antibody therapeutics could inhibit the replication of PRRS virus.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又名蓝耳病，由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用和持续性感染等特征，现有疫苗对该病的保护作用非常有限，而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。因此，新型抗PRRS病毒药物的研发具有重要意义。PRRS病毒为单股正链RNA病毒，其基因的复制和转录依赖于病毒自身编码的非结构蛋白，其中非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，是病毒最重要的复制酶。最新的研究发现Nsp9不仅能与一些宿主细胞蛋白和病毒蛋白自身发生互作，对病毒影响病毒增殖，而且Nsp9与病毒的毒力也有着密切的关系。因此，Nsp9非常合适作为抗病毒药物的靶点。综上所述，现有技术存在的问题是：尽管将防控PRRS病毒感染的注意力集中在研发疫苗，但是由于PRRS病毒基因的持续变异，现有疫苗对该病的保护作用非常有限。因此，利用基因工程抗体治疗剂抑制该病毒的复制将有利于提升抗该病的能力。本专利技术人所在团队在抗PRRS病毒感染研究领域处于国际领先地位(TaofengDu,YuchenNan,ShuqiXiao,QinZhao,andEn-MinZhou*.AntiviralStrategiesagainstPRRSVInfection.TrendsinMicrobiol.2017:25(12),968-979.doi:10.1016/j.tim.2017.06.001.)。因此，本专利技术专利内容将有望开发出抗PRRS病毒的特效药物。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂。本专利技术是这样实现的，一种抑制PRRS病毒复制的抗体，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQIDNO:1。本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体核苷酸序列的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂。本专利技术的另一目的在于提供一种所述抗体治疗剂的合成与纯化方法，所述抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：步骤一，利用PCR技术，扩增获得编码抗体治疗剂的DNA序列，酶切后，连接到原核表达载体pET21b中，获得原核表达载体；步骤二，将表达载体转化入表达用感受态细胞内，活化后涂布于AMP抗性的LB琼脂平板上培养；步骤三，挑取单克隆菌落，经IPTG诱导表达抗体治疗剂，表达的抗体治疗剂的C端带有His标签蛋白；经镍柱亲和层析法，获得纯度为90％以上的抗体治疗剂。本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体的表达载体，所述表达载体包含核苷酸序列。进一步，所述表达载体表达抗体治疗剂，抗体治疗剂进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体的治疗PRRS药物。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：利用酶联免疫实验，证明抗体治疗剂与PRRS病毒Nsp9的互作。将细胞与抗体治疗剂共孵育，利用间接免疫荧光实验证明了抗体治疗剂能够进入细胞。同时利用抗体治疗剂进行病毒抑制试验，证明了抗体治疗剂能够抑制PRRS病毒的复制。本专利技术通过原核表达得到了抗体治疗剂。此抗体治疗剂既具有进入细胞的功能，又可以特异性结合Nsp9，实现了纳米抗体在细胞内发挥抗PRRS病毒增殖的作用。该抗体治疗剂可以开发为治疗PRRS的药物，为PRRS的防治提供了一个新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。附图说明图1是本专利技术实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂的合成与纯化方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的抗体治疗剂核酸电泳图和抗体治疗剂蛋白电泳图；图中：(a)抗体治疗剂核酸电泳图，泳道M是DNA分子标准；(b)抗体治疗剂蛋白电泳图，泳道M是蛋白质分子标准。图3是本专利技术实施例提供的酶联免疫法(ELISA)实验鉴定抗体治疗剂与Nsp9互作示意图。图4是本专利技术实施例提供的间接免疫荧光实验检测抗体治疗剂进入PAMs细胞中示意图。图5是本专利技术实施例提供的不同PRRSV毒株接种细胞48小时后示意图；图中：(a)细胞内PRRS病毒Nsp9基因水平；(b)培养上清中子代病毒滴度(TCID50)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有疫苗对该病的保护作用非常有限，而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物的问题。本专利技术的抗体治疗剂可以开发为治疗PRRS的药物，为PRRS的防治提供了一个新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQIDNO:1。本专利技术实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体具有DNA序列所编码的氨基酸序列。本专利技术实施例提供的表达载体，含有DNA序列。表达载体能够表达抗体治疗剂，所述抗体治疗剂能够进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，能抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。抗体治疗剂，可用于开发成治疗PRRS的药物。如图1所示，本专利技术实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：S101：利用PCR技术，扩增获得编码抗体治疗剂的DNA序列，酶切后，连接到原核表达载体pET21b中，获得原核表达载体；S102：将该表达载体转化入表达用感受态细胞内，活化后涂布于AMP抗性的LB琼脂平板上培养；S103：挑取单克隆菌落，经IPTG诱导表达抗体治疗剂，表达的抗体治疗剂的C端带有His标签蛋白；经镍柱亲和层析法，获得纯度为90％以上的抗体治疗剂。下面结合具体实施例对本专利技术的应用效果作详细的描述。实施例1原核表达抗体治疗剂：通过两轮PCR(引物以及模板如下)，扩增得到编码抗体治疗剂的基因。使用NdeI与XhoI(购自NEB)酶切20μgpET21b原核表达载体及第二轮PCR回收产物，后用T4DNA连接酶于16℃过夜连接两片段。取10μl连接产物转化至50μl表达用感受态细胞BL21(DE3)中，活化后涂布于LBAMP+琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单菌落于LBAMP+液体培养基中37℃，220rpm培养12h，将菌液PCR鉴定为阳性的菌液进行测序分析。测序结果为阳性的菌液接种于LBAMP+培养基中培养，待细菌生长至对数期，用1mMIPTG诱导抗体治疗剂的表达，37℃，220rpm培养6h后，4℃，10,000g离心10min收菌体。PBS重悬菌体，利用超声波破碎菌体后，4℃，12,000g离心10min，由于抗体治疗剂主要以包涵体形式表达，所以收集沉淀。将沉淀溶解于8M尿素，经镍柱(购自Roche公司)纯化得到纯度90％以上的抗体治疗剂。变形的抗体治疗剂在复性液中复性后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制PRRS病毒复制的抗体，其特征在于，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种抑制PRRS病毒复制的抗体，其特征在于，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQIDNO:1。2.一种包含权利要求1所述抑制PRRS病毒复制的抗体核苷酸序列的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂。3.一种如权利要求2所述抗体治疗剂的合成与纯化方法，其特征在于，所述抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：步骤一，利用PCR技术，扩增获得编码抗体治疗剂的DNA序列，酶切后，连接到原核表达载体pET21b中，获得原核表达载体；步骤二，将表达载体转化入表达用感受态细胞内，活化后涂布于AMP抗性的LB琼脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：周恩民，王立珍，张璐，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61