一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用，所述荧光探针为3‑苯并噻唑基‑香豆素‑7‑酚酯类衍生物；采用荧光探针作为GSH的特异性探针，所述荧光探针的酯键可以识别GSH中巯基基团，生成具有荧光属性的取代物，为off‑on型荧光反应。本发明专利技术将香豆素与苯并噻唑连接作为一种新型的荧光探针，通过荧光的产生与淬灭实现检测，具有较高的检测灵敏度。本发明专利技术提供的荧光探针的细胞毒性小，所述荧光探针的结构以香豆素作为母核，对细胞的毒性作用较小，且具有良好的生物相容性，可广泛应用于活细胞、组织体内。本发明专利技术中荧光探针的检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中GSH的定量测定。

A fluorescent probe with high specificity for detecting GSH and its application

The invention discloses a fluorescent probe with high specificity for detecting GSH and its application. The fluorescent probe is 3 benzothiazolyl coumarin 7 phenolic ester derivative. The fluorescent probe is used as a specific probe of GSH, and the ester bond of the fluorescent probe can identify the thiol group in GSH, and generate a fluorescent substituent, which is off-on type fluorescence reaction. The invention connects coumarin with benzothiazole as a new fluorescent probe, realizes detection by fluorescence generation and quenching, and has high detection sensitivity. The fluorescent probe provided by the invention has low cytotoxicity. The structure of the fluorescent probe takes coumarin as the mother nucleus, has less toxicity to cells and good biocompatibility, and can be widely used in living cells and tissues. The detection process of the fluorescent probe in the invention is not easily disturbed by the matrix and impurities of the biological system, and can be used for the quantitative determination of GSH in various biological systems.

【技术实现步骤摘要】
一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用
本专利技术属于精细化工的
，具体涉及一种高特异性检测GSH的荧光探针及应用。
技术介绍
GSH是一种广泛存在于各种生物细胞内含有巯基、氨基和γ-酰胺键的三肽，主要由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，这一特异结构使其成为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，承担保护蛋白质等生物大分子，减少自由基对各种生物大分子的侵袭和生物膜的损伤，维持红细胞膜的完整性，以及DNA的生物合成和细胞免疫等多种生理功能。此外，GSH可与进入人体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进其排出体外，起到中和解毒的作用。研究证实，生物细胞内GSH含量变化与癌症、心脏病、阿尔兹海默症等疾病的致病机理及病理变化关系密切。目前，针对该物质的传统检测方法有比色法，电化学法，酶催化法以及高效液相色谱法等，然而这些方法操作复杂，成本较大，而且灵敏性与专一性不高。荧光探针检测法具有快速响应以及专一性强等优点，经过不断地发展，已成为一种十分普遍的方法进行各种生物活性分子的检测。因此，开发快速、高效、高特异性的GSH表征技术和方法具有重要的生物医学价值。近年来，荧光探针作为一种新型的检测技术，具有高效，快捷，特异性强等优点。然而，针对目前报道的GSH荧光探针而言，多数检测的为巯基，未能区分GSH、CYS(半胱氨酸)以及HCYS(高半胱氨酸)。考虑到GSH的生物内源性，激发光需减少对细胞组织的损伤。本专利技术提供了一类3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物作为GSH荧光探针底物的应用，基于GSH中硫醇结构的还原性，使荧光探针中的化学键断裂，生成具有荧光属性的取代物。该荧光探针反应可区分均含有巯基的GSH、CYS及HCYS，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、响应时间短以及无创性的特点，尤其可用于活细胞、组织甚至动物体内原位检测动态变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高特异性检测GSH的荧光探针，本专利技术将香豆素与苯并噻唑连接作为一种新型的荧光探针，通过荧光的产生与淬灭实现检测，具有较高的检测灵敏度。本专利技术提供的荧光探针的细胞毒性小，所述荧光探针的结构以香豆素作为母核，对细胞的毒性作用较小，且具有良好的生物相容性，可广泛应用于活细胞、组织体内。本专利技术还提供了一种高特异性检测GSH的荧光探针的应用，本专利技术将荧光探针应用到GSH的检测，所述荧光探针与GSH发生取代反应，属off-on型荧光反应，从而实现复杂生物样品中GSH含量的快速检测，具有较好的实用性。进一步的，本专利技术将探针与GSH反应生成具有荧光属性的反应物，从而利用探针对多种生物体系中GSH的分布和功能进行定量评价。本专利技术主要通过以下技术方案实现：一种高特异性检测GSH的荧光探针，所述荧光探针为3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物，所述荧光探针的结构通式如下：其中，R1为烷基、烃基、炔基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基取代基中的任意一种；所述R2为卤素原子。为了更好的实现本专利技术，进一步的，所述荧光探针以3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应得到3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物。为了更好的实现本专利技术，进一步的，所述R2为氯原子或溴原子。本专利技术主要通过以下技术方案实现：一种高特异性检测GSH的荧光探针的应用，采用荧光探针作为GSH的特异性探针，所述荧光探针的酯键可以识别GSH中巯基基团，生成具有荧光属性的取代物，为off-on型荧光反应。为了更好的实现本专利技术，进一步的，所述探针的浓度为1～100μM，且反应中DMSO含量5～50％(v/v)。为了更好的实现本专利技术，进一步的，在缓冲溶液中，反应温度为20℃～60℃，孵育体系pH为5.5～10.5。根据权利要求6所述的一种高特异性检测GSH的荧光探针的应用，其特征在于，在缓冲溶液PBS或Tris-HCl中，反应温度为37℃，孵育体系pH为7.4。为了更好的实现本专利技术，进一步的，反应时间为20～30分钟，所述荧光探针的浓度为0～30μM。为了更好的实现本专利技术，进一步的，采用荧光检测器对荧光进行检测，细胞成像的荧光检测参数为：激发波长450nm，发射波长460～650nm。为了更好的实现本专利技术，进一步的，定量荧光检测参数为：激发波长450nm，发射波长500nm。本专利技术提供的人活细胞GSH的高特异性荧光探针底物的应用，其取代物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；定量荧光检测条件为：激发波长450nm，发射波长500nm；细胞成像条件为：激发波长450nm，在460～650nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针反应的检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中GSH的定量测定。所述氨基酸为人或动物组织制备液、或各类组织细胞的生物样品。该特异性探针反应可用于人及动物组织制备液及各类组织细胞中GSH含量的定量测定。通过选择性评价，以及反应动力学等多方面的证据，证明3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物可经GSH代谢，生成相应的取代物。作为GSH的高特异性荧光探针，该化合物可以用来检测GSH的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的GSH的含量测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的细胞胞质、线粒体等制备物中GSH的含量测定。本专利技术的有益效果：(1)具有香豆素母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450～650nm)。本专利技术将香豆素与苯并噻唑连接作为一种新型的荧光探针，通过荧光的产生与淬灭实现检测，具有较高的检测灵敏度。(2)本专利技术提供的荧光探针的细胞毒性小，所述荧光探针的结构以香豆素作为母核，对细胞的毒性作用较小，且具有良好的生物相容性，可广泛应用于活细胞、组织体内。(3)所述荧光探针以3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应得到3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物。本专利技术制备荧光探针的方法简单，制备成本低，具有较好的实用性。(4)本专利技术将荧光探针应用到GSH的检测，所述荧光探针与GSH发生取代反应，属off-on型荧光反应，从而实现复杂生物样品中GSH含量的快速检测，具有较好的实用性。(5)所述荧光探针的浓度为0～30μM。本专利技术中荧光探针在0～30μM的浓度区间内线性良好(R>0.99)。(6)本专利技术将3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物与GSH发生特异性反应生成一个代谢产物，即具有荧光属性的3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素，从而实现复杂生物样品中GSH含量的快速检测，本专利技术可以利用探针对多种生物体系中GSH的分布和功能进行定量评价，具有较好的实用性。(7)本专利技术中特异性探针反应的检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中GSH的定量测定。附图说明图1为3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物的结构通式示意图；图2为3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物的合成路线图；图3为2-氯乙酸3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯的质谱图；图4为3-氯丙酸3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯的质谱图；图5为3-溴丙酸3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯的质谱图；图6为2-氯乙酸3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯的1H-NMR谱图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高特异性检测GSH的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为3‑苯并噻唑基‑香豆素‑7‑酚酯类衍生物，所述荧光探针的结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种高特异性检测GSH的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物，所述荧光探针的结构通式如下：其中，R1为烷基、烃基、炔基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基取代基中的任意一种；R2为卤素原子。2.根据权利要求1所述的一种高特异性检测GSH的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针以3-苯并噻唑基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应得到3-苯并噻唑基-香豆素-7-酚酯类衍生物。3.根据权利要求1或2所述的一种高特异性检测GSH的荧光探针，其特征在于，所述R2为氯原子或溴原子。4.一种高特异性检测GSH的荧光探针的应用，其特征在于，采用荧光探针作为GSH的特异性探针，所述荧光探针的酯键可以识别GSH中巯基基团，生成具有荧光属性的取代物，为off-on型荧光反应。5.根据权利要求4所述的一种高特异性检测GSH的荧光探针的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁思成，李昊，刘增金，吕沐瀚，吴建明，齐晓怡，邓明明，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：四川,51